整合气相色谱-质谱（GC–MS）、高通量测序和机器学习技术，以阐明意大利风味干腌火腿的风味形成过程及其中微生物群落的演替规律

《Food Research International》：Integrating GC–MS, high-throughput sequencing, and machine learning to elucidate flavor development and microbial succession in Italian-style dry-cured ham

李斯特菌质粒通过调控旗菌组装、碳水化合物代谢及氨基酸代谢影响生物膜形成，多组学分析揭示了质粒介导的代谢重编程和胞外基质合成机制。

Jing Wang|Hui-Min David Wang|Yang Qu|Ting Lin|Changyan Zhou|Zijie Lin|Yangtai Liu|Zhuosi Li|Qingli Dong|Yujuan Suo

上海科学技术大学健康科学与工程学院，中国上海200093

摘要

单核细胞增生李斯特菌通过在多种通常具有挑战性的环境中形成生物膜来生存，这些生物膜起到了保护性物理屏障的作用。虽然质粒已被证实可以增强生物膜的形成，但其背后的调控机制仍大部分尚未被探索。在这项研究中，我们从33个食品来源的菌株中选取了代表性的野生型单核细胞增生李斯特菌及其经过质粒处理的对应菌株，依据的是它们的生物膜形成能力降低率。我们在各种与食品相关的压力条件下评估了它们的生物膜形成能力，并进行了全面的多组学分析。进一步验证了野生型菌株与经过质粒处理的菌株在关键调控途径上的表型差异，以系统地阐明质粒介导的生物膜调控的分子机制。研究结果确定了三个关键的质粒调控途径：(i) 鞭毛组装和外蛋白生物合成，这些过程通过两组分系统（TCS）进行调控，质粒处理后的菌株表现出初始聚集能力和细胞外蛋白含量降低；(ii) 碳水化合物代谢，特别是通过磷酸转移酶系统（PTS）调节果糖/甘露糖代谢和d-葡萄糖合成，实验结果表明这显著降低了质粒处理后菌株的EPS含量；(iii) 氨基酸代谢，特别是涉及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢途径也受到影响；然而，补充氨基酸未能使生物膜形成恢复到野生型水平，这表明存在更复杂的调控相互作用。总体而言，这些发现首次系统地解析了单核细胞增生李斯特菌中质粒介导的生物膜调控机制，将移动遗传元件与运动性、代谢重编程和基质产生的协调控制联系起来。这项研究加深了我们对单核细胞增生李斯特菌生物膜生理学的理解，并为开发针对食品相关环境中生物膜的策略提供了科学基础。

引言

单核细胞增生李斯特菌是一种主要的食源性病原体，广泛存在于自然环境和食品加工设施中（Okoye等人，2025年）。它可以引起李斯特菌病，这是一种致命性疾病，尤其是在免疫系统受损的人群、孕妇和老年人中死亡率较高（Jin等人，2024年）。近年来，越来越多的单核细胞增生李斯特菌感染暴发与受污染的即食食品和新鲜农产品有关（Bae等人，2025年）。该菌在食品生产链中的持久性主要归因于其耐受环境压力的能力，包括低温、酸度、消毒剂和渗透压（Liu等人，2024年），这主要是通过形成坚固的生物膜实现的（Elafify等人，2024a）。

生物膜是由多糖、蛋白质和细胞外DNA组成的自产细胞外基质中的结构化微生物群落（Schmidt等人，2025年）。在这种状态下，单核细胞增生李斯特菌能够牢固地附着在食品接触表面，抵抗清洁剂，并逃避消毒，给食品安全管理带来了严重挑战（Elafify等人，2024b）。尽管长期以来人们一直在研究染色体因素和应激响应基因与生物膜形成的关系，但移动遗传元件，尤其是质粒，最近被证明是重要的影响因素（Mao等人，2021年）。虽然质粒对生存不是必需的，但它们通常携带赋予抗性、耐受压力和增强环境适应性的辅助基因（Calvo-Villama?án等人，2025年）。

最近的研究报告称，高达90%的单核细胞增生李斯特菌菌株携带质粒，这些质粒可能有助于提高酸性和盐的耐受性、消毒剂抗性以及更强的生物膜形成能力（Zhang等人，2018年）。然而，质粒介导的生物膜发育调控的精确分子机制仍大部分不清楚。以往的大部分工作集中在质粒编码基因的功能注释或抗性标记上。例如，在枯草芽孢杆菌中，质粒编码的rapP基因通过重新编程全局蛋白质组资源来增强生物膜形成（Zhu等人，2024年），而肺炎克雷伯菌的质粒含有多个抗性位点和应激响应系统（Hamed等人，2024年）。在单核细胞增生李斯特菌中，组学研究将质粒携带的基因与环境压力抗性联系起来（Kropac等人，2019年），并且认为毒素、抗毒素模块和ncRNA等调控系统可能调节其持久性（Ma等人，2024年）。

尽管取得了这些进展，但在食品相关生物膜控制的背景下，质粒如何影响宿主的调控途径（如信号转导、运动性和代谢适应）仍不清楚。为此，本研究旨在探讨质粒如何调控单核细胞增生李斯特菌的生物膜形成。通过对来自食品环境的野生型菌株和经过质粒处理的菌株进行整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析，我们确定了参与鞭毛组装、碳水化合物代谢和细胞外基质生物合成的关键质粒调控途径。这些发现为质粒驱动的生物膜调控提供了新的机制见解，并为改善食品卫生和生物膜控制策略提供了潜在的分子靶点。

细菌菌株和培养条件

共有33株携带质粒的单核细胞增生李斯特菌菌株，之前从新鲜农产品中分离出来，并储存在-80°C的冰箱中。为了复苏这些冷冻保存的菌株，首先将它们接种到脑心浸液（BHI；OXOID，美国）培养基上过夜培养。随后，选择单个菌落并接种到5毫升BHI肉汤培养基中，在37°C下培养，以产生10^8–10^9 CFU/mL的菌株接种物。

质粒去除和筛选

将菌株接种物引入

质粒去除可减少单核细胞增生李斯特菌的生物膜形成

为了阐明质粒在生物膜形成中的作用，本研究首先对33株野生型菌株及其相应的质粒处理后的衍生物进行了生物膜形成的定量分析。质粒去除导致所有检测菌株的生物膜生物量减少（图1）（质粒处理菌株的减少率与野生型在补充材料中的表S1中提供）。值得注意的是，LM95菌株在质粒去除后生物膜形成能力下降最为明显

讨论

单核细胞增生李斯特菌在食品加工环境中形成的生物膜是其持续存在和污染暴发反复发生的关键因素。生物膜不仅提供了保护病原体免受常规消毒的物理屏障，还使其能够在设备表面上持续定植，从而对公共卫生构成重大且持续的威胁。鉴于传统物理和化学方法在消除这种顽固生物膜方面的局限性，

结论

本研究通过去除33株携带质粒的单核细胞增生李斯特菌的质粒并评估其表型和分子反应，系统地研究了质粒在生物膜形成中的作用。与野生型菌株相比，质粒处理后的菌株的生物膜生物量显著减少。在食品相关的压力条件下，野生型菌株在生物膜形成方面具有更大的优势，这突显了质粒在维持

CRediT作者贡献声明

Jing Wang：写作 – 审稿与编辑，撰写原始草稿，可视化，验证，调查，正式分析，数据管理。Hui-Min David Wang：写作 – 审稿与编辑，撰写原始草稿，验证，调查。Yang Qu：资源获取，数据管理。Ting Lin：资源获取，数据管理。Changyan Zhou：资源获取，资金筹集。Zijie Lin：正式分析，数据管理。Yangtai Liu：验证，数据管理。Zhuosi Li：验证，调查。Qingli Dong：写作

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：32572724）、农产品质量安全风险评估专项（编号：GJFP20240202）（由中国农业农村部资助）以及上海农业科学院应用基础研究（资助编号：2025–09）的支持；同时得到了台湾科技部（资助编号：111–2221-E-005-026-MY3和111–2221-E-005-009）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。