阿尔茨海默病中携带miRNA34的小细胞外囊泡：对氧化应激、神经炎症、认知功能以及线粒体/铁死亡相关蛋白调控的影响

《Gene》：Small extracellular vesicles carrying miRNA34 in Alzheimer’s disease: effects on oxidative stress, neuroinflammation, cognitive function, and mitochondrial/ferroptosis-related protein regulation

阿尔茨海默病（AD）治疗研究聚焦于miRNA34负载的牛乳外泌体（sEV）在Aβ诱导小鼠模型中的疗效，证实其可显著缓解氧化应激、神经炎症及线粒体功能障碍，同时改善认知功能，表明sEV递送miRNA34是AD的微创治疗新策略。

　　

哈米特·切利克（Hamit ?elik）|奥乌兹·切利克（O?uz ?elik）|谢伊玛·阿伊丁（?eyma Ayd?n）|塞法·库丘克勒（Sefa Kü?ükler）|塞利姆·乔马克利（Selim ?omakl?）|艾哈迈德·托帕尔（Ahmet Topal）|拉马赞·阿卡伊（Ramazan Akay）|西纳恩·贡尤卢（Sinan G?nüllü）|穆斯塔法·奥努尔·耶尔德兹（Mustafa Onur Y?ld?z）|布伦特·阿利姆（Bülent Al?m）|塞尔丘克·奥兹德米尔（Sel?uk ?zdemir）

土耳其埃尔祖鲁姆（Erzurum）布哈拉医院（Buhara Hospital）神经科

摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是认知能力下降、氧化应激和持续的神经炎症。最近的研究越来越多地关注微小RNA（microRNAs, miRNAs）在AD发病机制中的调节作用。在本研究中，我们探讨了富含miRNA34的小型细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）针对AD关键病理机制的治疗潜力。我们假设负载miRNA34的sEVs可以减轻氧化损伤、抑制神经炎症反应和铁死亡（ferroptosis）、减轻线粒体损伤，并最终改善认知功能。我们在一个由Aβ诱导的AD小鼠模型中评估了miRNA34对氧化应激标志物、促炎细胞因子、突触可塑性指标和行为结果的影响。实验设计包括五个组，每组七只小鼠。研究结果表明，负载miRNA34的sEVs显著降低了氧化应激和神经炎症，同时增强了记忆和学习表现。总体而言，我们的结果表明，富含miRNA34的sEVs代表了一种有前景且侵入性最小的治疗策略，能够调节AD的发病机制。这项研究为miRNA34和sEVs在神经退行性疾病中的潜在临床应用提供了新的视角。

引言

阿尔茨海默病（AD）是导致痴呆最常见的原因，约占所有病例的70%，由于其高护理负担而成为重大的医疗挑战。错误折叠和聚集的β-淀粉样蛋白（Aβ）肽以及过度磷酸化的tau蛋白（p-tau）在神经元内的沉积是AD最重要的病理学原因。在AD患者中发现了星形胶质细胞和小胶质细胞的组织学异常，但这些异常被认为是次要的伴随效应（Heneka等人，2025年）。与AD相关的研究方法之一是AD的治疗研究。到目前为止，尚未开发出能够成功治疗AD的有效药物。这种情况表明AD的发病机制非常复杂。因此，一直强调需要探索不同的治疗方法。

微小RNA（miRNAs）是一类长约20个核苷酸的非编码RNA。它们的主要机制是通过结合目标mRNA的3′ UTR或抑制翻译来调节蛋白质表达。多项研究强调了miRNAs的生物标志物潜力及其在AD病理学中的治疗作用。其中一种候选miRNA是miRNA34，据报道它在生物系统中以及多种疾病的发病机制中起着重要作用。它已被证明可以靶向BMP7、TGF-β和CXCL9基因参与免疫反应；调节MET、TRAF5和DDX11基因参与肿瘤抑制；以及靶向SIRT1基因参与代谢途径。此外，它还被发现影响糖尿病中的SIRT1/FoxO3a轴和心血管疾病中的Smad4/TGF-β1轴，并参与肥胖相关过程（Hua等人，2021年；Kaller等人，2011年；Perdoncin等人，2021年；Wan等人，2012年；Wang等人，2020年；Wu等人，2021年）。

最近的研究表明，miRNA34在与神经疾病（如重度抑郁症、精神分裂症、不良童年经历（ACEs）和创伤、AD以及神经可塑性相关的信号通路中发挥作用（Bazrgar等人，2021年；Chen等人，2021年；Grossi等人，2021年）。具体来说，miRNA34在大脑的运动神经元中高度表达，它靶向参与能量代谢、抗氧化防御、突触形成和存活、神经可塑性、Aβ清除、线粒体功能和抗氧化防御系统的基因（Jauhari等人，2018年）。越来越多的证据表明，miRNA-34家族在大脑中的过度表达可能通过靶向和抑制参与能量代谢、抗氧化防御、突触形成和存活、神经可塑性、Aβ清除和线粒体功能的基因而显著促进AD的发病机制。此外，miR-34家族在肝脏和胰腺中的水平升高已被证明会促进代谢性疾病的发展，特别是糖尿病和肥胖。根据先前的研究，代谢紊乱是散发性AD的已知风险因素（Bazrgar等人，2021年）。神经元中含有大量的miR-34a，尤其是在运动神经元中。先前的研究表明，miR-34a通过靶向SIRT1和调节p53活性对神经元的正常发育至关重要。先前的研究还表明，miR-34a-5p可能与C9orf72相关病理生理过程和神经元退化有关（Kmetzsch等人，2021年）。miR-34a家族的成员有助于神经元的存活、分化和突触功能成熟。此外，miR-34a的异常表达与神经元凋亡有关。迄今为止获得的结果表明miRNA34在AD治疗中的潜力。

近年来，先进的药物递送系统在制药技术的发展中处于前沿。小型细胞外囊泡（sEVs），作为膜结合的纳米颗粒，在细胞间通信中起着关键作用，并为药物递送提供了有希望的潜力。其中，最重要的特点是它们能够携带生物物质（如蛋白质、脂质和核酸）、被靶细胞内化、克服生物屏障、具有生物相容性以及能够装载外源性生物活性物质（Du等人，2023年）。此外，所有细胞都可以分泌sEVs，它们存在于许多体液中，如血液、唾液、尿液和牛奶中。sEVs的一个关键机制是将其载荷递送到其他细胞。受体-配体相互作用、内吞作用以及与靶细胞膜的结合，所有这些过程都参与了载荷向靶细胞的递送（Gurung等人，2021年；Jab?ońska等人，2024年）。尽管具有这些特性，但在使用sEVs作为纳米递送载体时仍存在一些挑战，例如选择合适的起始生物材料、使用最适当的分离方案以及生产规模的可扩展性（Buschmann等人，2021年；Erdbrügger等人，2021年；Reseo等人，2024年）。

牛乳来源的sEVs在靶向纳米递送技术方面具有显著潜力。这一潜力归因于几个关键特性，包括它们能够封装和保护生物活性化合物，从而提高其稳定性和生物利用度。此外，牛奶来源的sEVs是一种容易获得且成本效益高的天然sEV来源。多项研究表明，可以在牛奶来源的sEVs中递送治疗剂、化学预防或化疗药物、生物活性天然化合物和miRNAs（Aqil等人，2017年；Del Pozo-Acebo等人，2021a年；Jiang等人，2024年；Munagala等人，2016年；Vashisht等人，2017年）。生物相容性是用于智能药物技术的纳米颗粒或递送载体的关键要求。来自牛乳的sEVs具有高生物相容性，因为它们不会在体内引发显著的免疫反应。这些sEVs在各种生物环境中具有高稳定性，包括胃肠道和广泛的pH范围，使其特别适合用于药物递送应用（Mun等人，2022年）。

在这项研究中，我们旨在探讨负载miRNA34的牛乳来源sEVs在Aβ诱导的AD小鼠模型中的治疗潜力。我们通过进行氧化应激、神经炎症、铁死亡以及线粒体功能和结构的生物标志物分析来评估EV-miRNA34复合物的效果。我们首次在AD小鼠模型中证明，EV-miRNA34复合物显著减轻了AD发病机制中的关键病理过程。

小节片段

牛奶来源的小型细胞外囊泡的制备、纯化和表征

无菌牛乳直接从阿塔图尔克大学农场获取，并在+4°C下保存直至使用。为保持牛奶的无菌性，仅使用经过必要测试确认为无菌的样本。为了收集EV组分，使用了顺序离心和超速离心来提取sEV组分。总结来说，第一次离心步骤使用了1毫升牛奶（使用JLA 16.250转子，在4°C下以13,000×g离心30分钟，Beckman公司生产）

将miRNA34加载到sEVs中并对其进行表征

通过RT-PCR分析检测sEVs和sEV_miRNA34样本中的miRNA34表达。与sEVs相比，sEV_miRNA34组中的miRNA34水平显著增加（图1，p<0.001）。通过TEM、NTA和DLS技术评估了sEV_miRNA34的结构。TEM、NTA和DLS验证了自由sEVs和sEV_miRNA34的外观和组织结构（图2a–d）。使用纳米粒子跟踪分析（NTA）确定了粒子数量和尺寸。

讨论

由于全球人口老龄化，AD的患病率正在上升。目前全球AD患者人数估计为5740万，预计到2050年将增加到1.528亿。需求的增加与社会、经济、家庭和个人方面产生了重大影响（Cummings等人，2023年）。迫切需要能够预防或延缓AD的发展、减缓其进展或缓解其症状的治疗疗法。

作者贡献声明

哈米特·切利克（Hamit ?elik）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。奥乌兹·切利克（O?uz ?elik）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、项目管理、研究。谢伊玛·阿伊丁（?eyma Ayd?n）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、方法学、研究。塞法·库丘克勒（Sefa Kü?ükler）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、验证

伦理批准和参与同意

本研究遵循伦理原则，并获得了阿塔图尔克大学动物实验地方伦理委员会的批准（2025/06）。不需要签署知情同意书。

资金

不适用。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们要感谢布哈拉医院（Buhara Hospital）对我们的支持。