双仿生支架递送IL-4/纳米羟基磷灰石：设计策略与免疫调节内源性成骨机制解析

《ACS Applied Materials & Interfaces》：IL-4/Nanohydroxyapatite Codelivery in a Dual-Bionic Scaffold: Design and Immunomodulatory Endogenous Osteogenesis Mechanism

本文设计了一种结合3D打印螺旋二十四面体（Gyroid）结构聚己内酯/纳米羟基磷灰石（PCL/nHA）支架与海藻酸钠/明胶（SG）水凝胶的双仿生支架（PHS/SG@IL-4），通过真空灌注技术负载白细胞介素-4（IL-4），实现时序控释IL-4以驱动巨噬细胞M2极化，并协同nHA分解释放的Ca2+激活PI3K-AKT和钙信号通路，显著增强BMSCs成骨分化与HUVECs血管生成，在大鼠颅骨缺损模型中促进深部骨再生。该研究为解决大段骨缺损修复中血管化不足与免疫微环境失衡提供了新材料策略与机制见解。

　　

研究背景与挑战

大段骨缺损因自我修复能力有限，临床治疗依赖自体骨移植，但面临供体不足与二次手术创伤问题。现有人工骨材料如胶原与生物陶瓷存在力学强度不足或生物活性低等局限。成功骨再生的关键是在支架内部形成功能性血管网络，但即便具有理想孔径（100–850 μm）的支架，新骨形成也多局限于边缘区域，中心区域细胞浸润与血管化困难。

双仿生支架的设计与构建

研究通过熔融沉积成型（FDM）3D打印技术制备具有55%填充密度的Gyroid结构PCL/nHA支架（PHS），其互连多孔结构模拟天然骨微通道。进一步采用真空辅助技术将负载IL-4的SG水凝胶（SG@IL-4）灌注至支架内部，形成“软-硬”双仿生结构。扫描电镜（SEM）与能量色散X射线光谱（EDX）显示nHA均匀分散于PCL基质中，支架降解3个月后重量损失达19.9%。SG水凝胶在体温下发生溶胶-凝胶转变，FTIR光谱证实其化学结构，流变学测试显示存储模量（G′）在38°C以上低于损耗模量（G″），具备可注射性。IL-4释放实验表明，支架8天内累计释放约6%，避免了突释效应。

免疫调节与巨噬细胞极化机制

体外实验显示，PHS/SG@IL-4支架提取物显著促进RAW264.7巨噬细胞迁移（Transwell与划痕实验），并上调CCL2基因表达。细胞骨架染色与SEM形貌观察发现，该组巨噬细胞呈长梭形M2表型，长宽比显著增加。qRT-PCR与免疫荧光结果显示，M2标志物CD206、IL-10、Arg-1表达上调，而M1标志物iNOS、CCR7、TNF-α表达抑制。ELISA检测证实巨噬细胞条件培养基（MCM）中IL-10和TGF-β分泌增加，表明IL-4通过JAK1-STAT6通路驱动M2极化，创建抗炎微环境。

成骨与血管生成协同效应

将MCM与BMSCs共培养后，PHS/SG@IL-4组ALP活性与钙结节沉积（ARS染色）均显著增强。免疫荧光与qRT-PCR显示成骨标志物Runx2和OPN的蛋白与基因表达上调。同时，HUVECs在该组MCM作用下形成更密集的血管样网络（管形成实验），CD31阳性细胞比例增加，划痕愈合加速，表明M2巨噬细胞分泌的细胞因子协同促进血管生成。

转录组学与信号通路验证

RNA-seq分析发现PHS/SG@IL-4组BMSCs中964个基因上调，KEGG富集分析提示PI3K-AKT与钙信号通路激活。qRT-PCR验证了VEGFA、Runx2、OPN、Col6a6、BMP3等基因表达升高。Western blot显示p-AKT、Runx2、OPN蛋白表达增加，而PI3K抑制剂LY294002处理可逆转该效应，证实PI3K-AKT通路的关键作用。此外，钙信号通路相关基因Camk1g的上调提示nHA释放的Ca²⁺可能通过钙调蛋白激酶途径协同促 osteogenesis。

体内骨再生验证

在大鼠10 mm颅骨缺损模型中，Micro-CT与组织学分析表明，PHS/SG@IL-4组在6/12周时骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）显著高于对照组，骨小梁间距（Tb.Sp）降低。H&E与Masson染色显示该组缺损中心区新生骨与胶原沉积更丰富。免疫荧光进一步证实植入区CD206、Runx2、OPN、CD31表达上调，iNOS表达抑制，说明支架通过免疫调节促内源性成骨。

机制总结与展望

双仿生支架通过Gyroid拓扑结构提供成骨机械刺激，nHA释放Ca²⁺激活钙信号通路，而SG@IL-4水凝胶时序调控免疫微环境，三者协同放大PI3K-AKT通路信号，最终实现“免疫-成骨-血管生成”耦合再生。未来可结合智能pH响应水凝胶与大型动物负重模型优化临床转化潜力。