《Journal of Advanced Research》：Activated hepatic stellate cell-derived exosomal miR-23a-3p promotes hepatocellular carcinogenesis by regulating DUSP5/ERK signaling
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本研究聚焦于肝纤维化微环境中活化的肝星状细胞（HSC）如何促进肝细胞癌（HCC）发生这一关键科学问题。研究人员通过系统的体外和体内实验，揭示了活化的HSC通过分泌富含miR-23a-3p的外泌体，将其递送至肝细胞，进而直接靶向抑制DUSP5的表达，解除其对ERK信号通路的负向调控，最终驱动肝细胞恶性转化和肿瘤发生。该研究不仅阐明了纤维化向肝癌转变的新机制，也为肝癌的早期诊断和干预提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。
肝脏，作为人体最大的实质性器官，承担着解毒、代谢、合成等至关重要的生理功能。然而，这个“沉默的器官”也极易受到多种损伤因素的持续攻击，例如肝炎病毒感染、酒精滥用、代谢异常等。长期的慢性肝损伤会触发一个复杂的伤口愈合反应——肝纤维化，其特征是细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的过度沉积。当这种瘢痕反应失去控制，逐渐进展为肝硬化，肝脏的正常结构被扭曲的纤维隔和再生结节所取代，这就为肝癌的发生埋下了危险的种子。事实上，超过80%的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）正是在肝纤维化或肝硬化的背景上发展而来的，凸显了纤维化微环境是肝癌发生的“温床”。
在肝纤维化的舞台上，肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）是当之无愧的“主角”。在健康肝脏中，它们处于静息状态，储存维生素A，维持肝脏的正常功能。一旦肝脏受损，HSC便被“激活”，转变为增殖活跃的肌成纤维细胞，大量合成胶原等ECM成分，成为推动肝纤维化进程的主要效应细胞。更值得注意的是，持续活化的HSC进一步获得癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast, CAF）的特征，通过分泌多种细胞因子、生长因子，塑造一个利于肿瘤发生和发展的微环境。然而，活化的HSC是否以及如何直接“教唆”正常的肝细胞走上癌变之路，其中的具体通信机制此前尚不明确。
近年来，外泌体（exosome）作为细胞间通信的“特快专递”受到了广泛关注。这些由细胞分泌的纳米级囊泡，能够携带蛋白质、核酸（如microRNA）等生物活性物质，并将其传递给受体细胞，从而调控受体细胞的功能。在肿瘤领域，外泌体介导的细胞对话已被证明在肿瘤生长、血管生成、免疫逃逸和转移前微环境形成中发挥关键作用。那么，在纤维化向肝癌转变的过程中，活化的HSC是否也利用外泌体作为信使，向肝细胞传递“致癌指令”呢？这正是发表于《Journal of Advanced Research》的这项研究旨在解答的核心科学问题。
为了回答这一问题，研究人员运用了一系列关键技术方法。他们从活化的HSC细胞系（人LX-2和小鼠NIH/3T3）以及原代HSC中分离和鉴定了外泌体。通过体外共培养、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内成瘤实验，评估了HSC来源外泌体对肝细胞（人LO2和小鼠AML12及原代肝细胞）恶性转化的影响。利用小RNA测序筛选并验证了外泌体中的关键致癌性miRNA（miR-23a-3p）。通过转录组测序、生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验，确定了miR-23a-3p的直接靶基因DUSP5及其下游的ERK信号通路。通过功能获得和功能缺失实验（如miRNA mimics/inhibitors、过表达质粒、慢病毒、腺相关病毒AAV介导的基因调控）在细胞和动物层面（DEN+CCl4诱导的小鼠肝癌模型）验证了miR-23a-3p/DUSP5/ERK轴的功能。此外，还收集了临床肝硬化、癌前病变和HCC患者的肝组织活检和血液样本，通过qRT-PCR、蛋白质印迹（Western blot）、免疫组织化学和原位杂交等技术，分析了该信号轴在人类疾病进展中的相关性。统计学分析使用SPSS和GraphPad Prism软件完成。
活化的HSC来源的外泌体诱导肝细胞恶性转化
研究人员首先成功从静息和活化（TGF-β1诱导）的HSC中分离出外泌体，并经电镜、纳米流式细胞术和标志蛋白（CD9, CD63, CD81, TSG101, HSP70）检测证实。将活化的HSC来源的外泌体与肝细胞共培养后，发现能显著促进肝细胞在软琼脂中形成克隆的能力，表明其获得了锚定非依赖性生长的恶性表型。同时，肝细胞中恶性标志物C-MYC、去分化标志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）和细胞角蛋白19（cytokeratin 19, CK19）的表达水平在mRNA和蛋白层面均显著上调。此外，与肿瘤干细胞特性相关的基因（如CD133, LGR5, OCT-4, NANOG, CD90）的转录水平也大幅提高。最直接的证据来自体内实验：经活化HSC外泌体处理过的肝细胞，在注射到裸鼠皮下后，形成的肿瘤体积和重量均显著大于对照组。这些结果综合表明，活化的HSC确实能够通过释放外泌体，诱导肝细胞发生恶性转化和肿瘤形成。
外泌体miR-23a-3p驱动肝细胞恶性转化
那么，外泌体中究竟是哪种成分在发挥主导作用呢？研究者将目光投向了作为细胞间通信关键分子的microRNA（miRNA）。通过对静息与活化HSC来源的外泌体进行小RNA测序，他们发现miR-23a-3p、miR-10a-5p和miR-155-5p在活化HSC外泌体中显著富集。进一步的功能筛选显示，miR-23a-3p在提升肝细胞AFP、CK19和C-MYC表达方面作用最为突出。随后的实验证实，在肝细胞中过表达miR-23a-3p，能够模拟活化HSC外泌体的效果，即增强软琼脂克隆形成能力、上调恶性与干细胞相关标志物表达、并促进裸鼠体内成瘤。相反，在从纤维化肝癌模型分离的HCC细胞中敲低miR-23a-3p，则能抑制其恶性表型。这些发现确定了miR-23a-3p是活化HSC外泌体中介导肝细胞癌变的关键效应分子。
MiR-23a-3p直接靶向下调肝细胞中DUSP5的表达
接下来，研究深入探索了miR-23a-3p的作用靶点。通过对过表达miR-23a-3p的肝细胞进行转录组测序，并结合TargetScan和miRDB数据库预测，研究人员将目标锁定在双特异性磷酸酶5（dual-specificity phosphatase 5, DUSP5）。DUSP5是已知的肿瘤抑制因子，能够特异性去磷酸化并失活ERK信号通路。实验验证表明，miR-23a-3p过表达能显著降低肝细胞中DUSP5的mRNA和蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，miR-23a-3p可直接结合到DUSP5基因3'端非翻译区（3'-untranslated region, 3'-UTR）上的特定位点，从而抑制其表达。
MiR-23a-3p通过调控DUSP5-ERK轴诱导肝细胞癌变
机制层面的探究发现，在肝细胞中，miR-23a-3p过表达导致DUSP5下调后，随之而来的是ERK磷酸化（phosphorylated ERK, p-ERK）水平及其下游效应分子CyclinD1和C-MYC表达的升高，即ERK信号通路被激活。而在过表达miR-23a-3p的同时恢复DUSP5的表达，则可以有效阻断ERK通路的激活，并逆转miR-23a-3p所诱导的肝细胞软琼脂克隆形成能力和体内成瘤能力。在DEN+CCl4诱导的小鼠肝癌模型中，利用腺相关病毒（AAV）在体内敲低miR-23a-3p，可以显著减少肝脏肿瘤的数量和大小，并伴随DUSP5表达回升和p-ERK水平下降；而若同时敲低DUSP5，则会抵消敲低miR-23a-3p的抗肿瘤效果。这一系列的增益和补救实验，有力地证明了miR-23a-3p正是通过靶向抑制DUSP5，进而解除对ERK信号通路的刹车，最终驱动肝细胞癌变的。
miR-23a-3p/DUSP5/ERK轴在纤维化HCC进展中的动态激活
为了揭示该信号轴在疾病进展中的动态变化，研究人员在DEN/CCl4诱导的小鼠肝癌模型中进行了纵向分析。结果发现，随着肝纤维化进展至HCC，肝组织内miR-23a-3p的水平逐渐升高，而DUSP5的表达则进行性下降，p-ERK水平持续升高。进一步细胞分选显示，miR-23a-3p的升高最早出现在HSC中，提示HSC是循环和外泌体中miR-23a-3p的主要细胞来源。
miR-23a-3p/DUSP5/ERK轴与临床肝硬化-HCC进展的相关性
临床相关性分析进一步强化了该通路的重要性。在肝硬化、肝癌前病变和HCC患者的肝组织样本中，miR-23a-3p和p-ERK的蛋白表达水平随疾病进展而逐步上调，DUSP5的表达则逐步下调。相关性分析显示，miR-23a-3p与p-ERK水平呈正相关，而两者均与DUSP5水平呈负相关。此外，肝组织内miR-23a-3p的转录水平在疾病进展过程中也呈现渐进式升高，并且其过表达（定义为相对于健康对照>2倍）与疾病分期显著相关（肝硬化0/15，癌前病变10/15，HCC 15/15），而与年龄、性别无关。这些临床数据表明，miR-23a-3p/DUSP5/ERK信号轴的激活与人类从肝硬化到HCC的疾病进展密切相关。
结论与意义
本研究系统地阐明了肝纤维化微环境中活化的HSC促进HCC发生的一种新机制：活化的HSC通过分泌外泌体，将富含的致癌性miR-23a-3p递送至肝细胞；进入肝细胞后，miR-23a-3p直接靶向并抑制肿瘤抑制因子DUSP5的表达，从而解除DUSP5对ERK信号通路的负性调控，导致ERK通路持续激活，最终驱动肝细胞的恶性转化和肿瘤发生。这条“活化HSC-外泌体-miR-23a-3p-DUSP5-ERK”信号轴在实验性肝癌模型和临床患者样本中均显示出与疾病进展平行的动态激活。该研究不仅深化了对肝脏肿瘤微环境中基质细胞与实质细胞之间通信的理解，揭示了纤维化向肝癌转变的早期分子事件，而且将血浆外泌体miR-23a-3p和组织DUSP5/p-ERK信号轴推至舞台中央，为HCC的早期预警、风险分层以及开发针对该通路的新型干预策略提供了重要的理论依据和潜在的靶点。
