《Journal of Hazardous Materials》：Novel genomically engineered antibiotic-free whole-cell biocatalysts for PET hydrolysis and waste remediation
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PET降解的基因组整合稳定生物催化剂系统开发：通过CRISPR相关转座酶系统在E. coli染色体上整合PETase基因，利用优化Braun脂蛋白信号肽系统实现酶稳定表面展示，无需抗生素或诱导剂，经多代传代后仍保持高降解活性，并通过HPLC验证副产物生成，为规模化塑料污染生物降解提供可持续解决方案。
Katherine Romero-Orejon | Hamid Reza Karbalaei-Heidari | Nediljko Budisa | David Levin
曼尼托巴大学生物系统工程系，加拿大温尼伯
摘要
塑料污染是一个日益严重的环境问题，需要稳定且可持续的生物技术解决方案。本文报道了一种通过将PETase基因整合到大肠杆菌中，实现微生物降解PET的重大进展。该方法利用稳定的、无需诱导剂和抗生素的全生物催化剂。通过CRISPR相关转座酶系统，PETase基因被插入到特定的染色体位点，并在组成型启动子控制下表达，从而无需质粒或选择标记。在此基因组框架下，Braun脂蛋白信号肽（Lpp-SP）系统被优化，以高效地将PETase锚定并暴露在细菌表面，从而创建出强健的全细胞生物催化剂。通过生化测定、Western blotting和流式细胞术验证了PETase的表面定位和活性，结果表明其功能在多代培养后仍然保持稳定。经过17代培养后，EC-PET1中的酶活性仍保留了90%以上；经过10代培养后，EC-FP1中的酶活性约为70%。使用高效液相色谱（HPLC）鉴定出降解产物，包括单(2-羟乙基)对苯二甲酸（MHET）和对苯二甲酸（TPA）。优化后的大肠杆菌 EC-FP1菌株在OD600 = 1.0/mL的条件下，3天内从半结晶PET颗粒中产生了0.18 mM的MHET。这些结果证明了基因工程微生物作为大规模处理塑料废弃物的强大且可持续工具的可行性，同时避免了基于质粒系统的遗传不稳定性和代谢负担。
引言
塑料污染是现代最紧迫的环境挑战之一。每年产生的塑料废弃物超过4亿吨，但仅有不到10%得到有效回收，大部分塑料垃圾长期滞留在垃圾填埋场和自然生态系统中[1]、[2]。聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）因其耐用性和多功能性成为瓶子和纺织品的主要成分，占全球聚合物产量的约18%[3]。这种稳定性反而增加了其降解的难度，推动了可持续回收策略的探索。
大规模有效的酶促降解需要上游的机械处理（如粉碎成碎片或粉末），以增加生物催化剂可接触的表面积。在本研究中，我们使用市售的PET粉末作为标准化的高表面积模型底物，在受控条件下评估了我们工程化生物催化剂的核心性能，这些条件符合该领域的现有方法。
生物方法作为物理和化学回收的低能耗替代方案显示出巨大潜力[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。一个关键突破是发现了Ideonella sakaiensis 201-F6菌株，它利用两种酶系统降解PET：PETase将聚合物分解为可溶性中间体单(2-羟乙基)对苯二甲酸（MHET），随后MHETase将其进一步水解为单体对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）[9]、[10]、[11]。利用这些酶，合成生物学实现了全细胞生物催化剂的发展，主要通过在大肠杆菌[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]和酵母[19]、[20]、[21]等宿主细胞表面展示PETase来实现。例如，经过优化的大肠杆菌菌株在受控条件下对PET粉末的降解率超过了70%[22]、[23]、[24]。
然而，一个关键的可扩展性障碍仍然存在。现有系统主要依赖于基于质粒的表达方式，这需要持续补充抗生素和诱导剂，导致代谢负担增加、遗传不稳定以及高昂的运营成本，使得工业应用不切实际[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。在大规模生物过程中，失去质粒的细胞会抑制工程菌株的生长，导致工艺失败。为克服这些限制，我们开发了一种染色体整合策略，创建了稳定且无需抗生素的全细胞生物催化剂。我们使用CRISPR相关转座酶（CAST）系统VcTn6677，将基因构建精确地整合到
大肠杆菌的特定基因组位点，确保了无选择压力的稳定长期基因表达[31]、[32]、[33]、[34]。
我们的设计利用了
大肠杆菌天然的脂蛋白（Lpp）转运途径来实现酶的稳定展示。我们构建了包含组成型启动子（cLppP）、Lpp信号肽（Lpp-SP）和PETase编码序列的表达盒。如图1所示，Lpp-SP将融合蛋白导向SecYEG转运系统。经过二酰基甘油转移酶（Lgt）、信号肽酶II（LspA）和脱脂蛋白N-酰基转移酶（Lnt）的连续修饰后，成熟的蛋白质通过三酰基半胱氨酸（3AcCys）锚定在细胞表面。ABC转运蛋白LolCDE及其伴侣蛋白LolA和受体LolB将脂化蛋白转运到外膜（OM）进行整合[36]、[37]、[38]。
在我们的构建中，Lpp的C末端结构被PETase取代。通过基因组整合和表达，这种设计利用天然Lpp途径将PETase稳定地锚定在细胞表面，无需质粒、诱导剂或抗生素。
在本研究中，我们报道了基因工程改造的、无需抗生素的大肠杆菌生物催化剂用于PET水解的开发与表征。通过CAST将PETase表达盒直接整合到染色体中，我们创建了能够持续产生并表面展示活性酶的稳定菌株。这些全细胞催化剂在实验室条件下展示了降解PET颗粒和薄膜的能力。这一基于基因组的平台为下一代塑料废弃物生物催化提供了可扩展、稳定且可持续的基础。
材料
粒径小于300 μm的PET粉末购自Goodfellow Co（产品代码ES30-PD-000132）。BHET、MHET和TPA由Sigma-Aldrich提供，用作标准参考化合物。
生成Lpp缺失的大肠杆菌菌株（BL21-ΔLpp菌株）
采用CRISPR-Cas9辅助的基因组编辑技术，从内源性Lpp基因的末端删除了25 bp的编码序列，并引入了一个TAA终止密码子，从而在大肠杆菌 BL21（DE3）细胞的基因组中生成了截短的Lpp基因序列，具体方法参考先前发表的文献[33]。
建立和验证表面展示平台：宿主菌株选择及基于质粒的3AcCys-PETase的活性
为了确定大肠杆菌中的天然Lpp是否干扰3AcCys-PETase的表达和正确定位，我们使用CRISPR-Cas9辅助的基因组编辑技术生成了大肠杆菌 BL21-ΔLpp菌株，该菌株是大肠杆菌 BL21(DE3)的Lpp基因敲除株[33]。通过针对大肠杆菌 BL21-ΔLpp基因组侧翼区域的引物扩增Lpp基因，确认了基因片段的成功删除。
讨论
我们采用合成生物学方法开发了一种全细胞生物催化剂，该催化剂通过N末端半胱氨酸三酰基锚（3AcCys）将PETase和FAST-PETase同时固定并暴露在溶剂中。因此，我们建立了一个稳定且无需抗生素的全细胞平台，可在适中的、生物兼容的温度下进行PET降解。这种方法与传统的策略互补，但在概念上有显著区别。
结论与展望
全球塑料污染危机需要可扩展且可持续的生物解决方案。虽然基于质粒的酶促PET降解系统显示出潜力，但它们对化学诱导剂、抗生素和不稳定遗传电路的依赖限制了其实际的大规模应用。
在这项工作中，我们通过使用CRISPR相关转座酶（CAST）将PETase表达盒永久整合到大肠杆菌基因组中，开发出了下一代全细胞生物催化剂平台。
环境影响
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）造成的塑料污染仍然是一个主要的环境问题，而酶促回收受到高成本、稳定性有限以及依赖抗生素或化学诱导剂的限制。在本研究中，我们通过基因工程改造大肠杆菌，使其能够直接从基因组中稳定产生并展示PET降解酶，从而消除了对外部选择标记或诱导剂及酶纯化步骤的需求。
CRediT作者贡献声明
K.L.R.O.负责概念构思、开发、实验设计、数据管理和初稿撰写。H.R.K.H.负责概念构思、开发、实验设计、数据管理和初稿撰写。N.B.参与概念监督、研究指导以及手稿的撰写和编辑。
CRediT作者贡献声明
David Bernard Levin：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、方法学研究、资金获取、概念构思。
Hamid Reza Karbalaei-Heidari：撰写、审稿与编辑、方法学研究、概念构思。
Nediljko Budisa：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、概念构思。
Katherine Romero-Orejon：初稿撰写、方法学研究、数据分析、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究的资金支持来自加拿大国家研究委员会（NSERC）的Discovery项目（RGPIN-2023-04787），由David Levin博士负责。Nediljko Budisa博士和Hamid Reza Karbalaei-Heidari博士感谢加拿大研究主席计划（项目编号950-231971）的支持；Katherine Romero-Orejon博士感谢加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）通过Discovery项目（RGPIN-04945-2017和RGPIN-05669-2020）提供的支持。特别感谢Gerstein博士的协助。
