《Journal of Virological Methods》：Development of an ELISA using recombinant dengue NS1 constructs to measure antibody titers and predict dengue disease outcome in a pediatric population in India
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抗体反应在登革热中主要针对病毒包膜（E）和膜（M）蛋白，但E蛋白抗体可能因交叉反应引发抗体依赖性增强（ADE），加重病情。本研究分析102名儿童登革热患者血清中NS1蛋白不同结构域（NS1A、NS1B）的抗体滴度，发现轻症（DOS）患者NS1A抗体水平显著高于重症（SD），提示NS1尤其是其N端区域抗体可能具有保护作用，为开发更安全疫苗提供依据。
Bharti Pathak|Aparna Chakravarty|N Veena Rani|Anuja Krishnan
印度德里-110062，贾米亚·哈姆达德大学分子医学系
摘要
登革热感染中的大多数抗体反应针对病毒的结构包膜（E）和膜（M）蛋白。然而，疫苗开发具有挑战性，因为针对E蛋白的抗体常常表现出交叉反应性，导致抗体依赖性增强（ADE）并加重疾病严重程度。非结构蛋白1（NS1）在感染急性期被分泌出来，已被认为是导致严重登革热患者血管通透性和出血的致病因素。在这项研究中，我们旨在探讨NS1抗体在疾病表现中的作用。全长NS1及其N端（NS1A）和C端（NS1B）区域被表达和纯化，以明确不同结构域所引发的抗体反应。使用ELISA方法分析了102名登革热阳性患儿的血清样本中针对这些NS1构件的抗体滴度。与重症患者相比，轻症患者对所有三种NS1重组蛋白的抗体滴度总体较高，其中NS1A的抗体滴度差异最为显著。这些发现表明，针对NS1的抗体，特别是其N端区域，可能具有保护作用，并可作为登革热感染的潜在保护指标。
引言
登革热是由四种登革热病毒（DENV）血清型之一引起的全球主要健康问题，这些病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）。大多数DENV感染是无症状的；然而，一部分患者会发展成以出血、血浆渗漏、血小板减少为特征的重症，极端情况下甚至会导致休克和死亡。为了便于早期识别和更好的临床管理，世界卫生组织（WHO）在2009年引入了修订后的登革热严重程度分类系统，将感染分为无预警信号的登革热（DOS）、有预警信号的登革热（DWS）和重症登革热（SD）（WHO，2009）。
DENV是一种有包膜的正义RNA病毒，其基因组大小约为10.9 kb，编码三种结构蛋白——衣壳（C）、包膜（E）和膜（M）——以及七种非结构蛋白——NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。成熟的病毒颗粒由包裹病毒基因组的衣壳蛋白以及嵌入脂质包膜中的M和E蛋白组成（Rani等人，2024；Rodenhuis-Zybert等人，2010）。其中，包膜（E）蛋白是中和抗体反应的主要靶标，也是大多数登革热疫苗策略的基础。解释登革热发病机制的主要假说之一是抗体依赖性增强（ADE），即先前感染异源DENV血清型后再次感染会加重疾病严重程度。先前感染产生的交叉反应性但亚中和抗体可以结合新的感染血清型，促进病毒进入携带Fcγ受体的细胞，从而增强病毒复制（Katzelnick等人，2017；Shukla等人，2020）。
在非结构蛋白中，NS1特别值得关注。它在细胞内以单体形式存在，在内质网（ER）中二聚化，并以六聚体形式分泌到血液中。NS1是唯一分泌到血液中的非结构蛋白，因此在感染急性期是一个有价值的诊断标志物（Muller和Young，2013）。在宿主细胞内，NS1在病毒复制中起关键作用（Gutsche等人，2011）。从结构上看，NS1是一种由352个氨基酸组成的糖蛋白，包含三个结构域：N端β卷曲结构域（1–29个氨基酸）、翼结构域（30–180个氨基酸）和β梯形结构域（181–352个氨基酸）。高分辨率晶体学分析表明，NS1是一种多结构域蛋白，包含N端β卷曲结构域（参与二聚化和膜结合）、翼结构域（参与免疫调节和宿主相互作用）和C端β梯形结构域（对寡聚化、分泌和致病功能至关重要）（Akey等人，2014；Edeling等人，2014）。
最近的研究表明，NS1直接参与了登革热的发病机制。分泌的NS1可以通过上调唾液酸酶、肝素酶和组织蛋白酶L来破坏内皮糖萼，导致血管通透性增加（Puerta-Guardo等人，2016）。它还可以激活Toll样受体4（TLR4），导致促炎细胞因子分泌和内皮通透性增加（Chao等人，2019）。此外，NS1与补体成分相互作用，通过抑制补体介导的清除作用帮助病毒逃避免疫系统（Conde等人，2016a）。
虽然登革热感染中的抗体反应传统上集中在结构蛋白如E蛋白上，但并非所有针对E蛋白的抗体都具有保护作用。一些表位会诱导非中和抗体，这些抗体能够介导ADE，这意味着E蛋白特异性反应并不总是与病毒载量或疾病严重程度相关（Katzelnick等人，2017；Pathak等人，2024）。相比之下，NS1是一个独特的免疫反应靶标，因为它不是成熟病毒颗粒的组成部分，因此不存在ADE的风险。NS1在感染急性期大量分泌，直接导致内皮功能障碍和血管渗漏，这是重症登革热的关键特征。针对NS1的抗体可能通过中和其致病效应提供保护作用，这一点已在多项体外和小鼠研究中得到证实（Lai等人，2017；Sanchez-Vargas等人，2024）。
然而，NS1抗体的作用仍存在争议。一些研究表明，NS1特异性抗体与宿主蛋白（包括血小板和凝血成分如纤溶酶原和凝血酶）发生交叉反应，可能导致内皮细胞凋亡并加重血管损伤（Cheng等人，2009；Sun等人，2007）。因此，NS1抗体在疾病保护与致病机制中的确切作用仍不清楚。
尽管多项动物研究证明了针对NS1的免疫具有保护潜力，但关于NS1特异性抗体反应及其与疾病严重程度相关性的临床数据仍然有限。本研究旨在明确儿童登革热患者中NS1抗体在不同结构域的分布，并探讨它们与临床结果之间的关联。识别这些免疫保护或致病的相关因素可能为疾病进展提供预测性生物标志物，并为开发更安全、更有效的登革热疫苗提供依据。
研究片段
患者血清样本
2017–2018年间，从南德里贾米亚·哈姆达德大学Hakeem Abdul Hameed Centenary（HAHC）医院的儿科病房收集了确诊为登革热感染的血清样本（NS1/IgM阳性，n = 102）。纳入标准包括：6个月至15岁的儿童，临床怀疑患有登革热感染。排除标准包括被诊断为其他发热性疾病或临床记录不完整的患者。参与研究的儿童均未报告有重大并发症。
Western Blot分析
使用Mini-PROTEAN Tetra System（Bio-Rad，美国）将SDS–PAGE分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（孔径0.45 μm；Millipore，美国）。转移过程在含有25 mM Tris、192 mM甘氨酸、0.1% SDS和20%（v/v）甲醇的转移缓冲液中，以200 mA的恒定电流进行3小时。
转移后，用含有0.05%（v/v）Tween-20（TBST）的Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.4）配制的3%（w/v）脱脂牛奶封闭膜1小时。
结果
我们之前报告了2021年入住印度新德里HAHC医院的102名确诊为登革热（NS1/IgM阳性）患者的人口统计信息、临床特征和实验室参数（Pathak等人，2021）。根据WHO 2009年的指南，其中44名患者被归类为无预警信号的登革热（DOS），52名为有预警信号的登革热（DWS），6名为重症登革热（SD）。根据IgM/IgG比值，42名患者被归类为初次感染。
讨论
在这项研究中，我们评估了不同疾病严重程度儿童患者对登革热病毒NS1蛋白的抗体反应。结果显示，无预警信号的登革热（DOS）患者的NS1抗体水平显著高于有预警信号的登革热（DWS）和重症登革热（SD）患者。NS1抗体水平与疾病严重程度之间的负相关表明，针对NS1的免疫可能具有保护作用。
未引用的参考文献
（《登革热：诊断、治疗、预防和控制指南（2009年版）》）
CRediT作者贡献声明
Anuja Krishnan：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源提供、概念构思。Bharti Pathak：初稿撰写、方法学设计。Aparna Chakravarty：资源提供、数据管理。N Veena Rani：方法学设计。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
