《International Journal of Genomics》：Mechanism of Non–Small Cell Lung Cancer–Derived Extracellular Vesicle miRNA hsa-let-7b-5p Targeting AP1S1 to Regulate M2 Macrophage Polarization
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本文揭示了非小细胞肺癌（NSCLC）来源的细胞外囊泡（EVs）通过递送miRNA hsa-let-7b-5p靶向AP1S1，进而调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向M2表型极化的新机制。研究发现该hsa-let-7b-5p/AP1S1/p53信号轴可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，为NSCLC免疫治疗提供了潜在新靶点。
背景
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占病例的80%以上。复杂的肿瘤免疫微环境（TIME）是导致治疗抵抗和预后不良的关键因素。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TIME的主要组成部分，其向免疫抑制性M2表型的极化显著促进肿瘤进展。研究表明，NSCLC细胞通过分泌细胞外囊泡（EVs）递送miRNAs来调控TAM极化，但具体分子机制尚不清楚。
材料与方法
研究通过高通量测序和生物信息学分析筛选关键调控靶点。采用Ki-67染色检测细胞增殖，流式细胞术分析细胞凋亡，RT-qPCR和Western blot检测mRNA和蛋白表达水平，Transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力，以探究NSCLC来源EVs中miRNA调控TAM极化的分子机制。从NSCLC细胞系A549和正常人支气管上皮细胞系BEAS-2B中成功分离并鉴定了EVs。对EVs的miRNA测序数据进行生物信息学分析，发现hsa-let-7b-5p/衔接蛋白相关蛋白复合体1 sigma 1亚基（AP1S1）轴可能是TAM极化的关键调节因子。
结果
EVs分离、表征及miRNA测序
透射电子显微镜（TEM）显示典型的杯状颗粒，粒径在30-150纳米之间。纳米颗粒跟踪分析（NTA）证实了相似的外泌体尺寸分布谱。Western blot验证了三种阳性外泌体标志物TSG101、CD63和CD9。随后对从A549和BEAS-2B细胞分离的EVs进行miRNA测序，共鉴定出67个差异表达miRNAs（DEmiRNAs），其中38个在A549来源的EVs中显著上调，29个显著下调。
DEmiRNAs和mRNA的筛选
基于TCGA-LUAD转录组数据的差异表达分析发现5404个差异表达基因，其中3399个显著上调，2005个显著下调。通过CIBERSORT算法评估差异基因表达与M2巨噬细胞浸润的相关性，筛选出499个M2浸润相关基因。单变量Cox回归分析显示121个基因与患者总生存期（OS）显著相关。其中，AP1S1和TNFRSF11A在肺腺癌组织中的表达显著高于正常组织，其高表达与M2巨噬细胞浸润增加和患者预后不良呈显著正相关。人类蛋白质图谱（HPA）的免疫组化结果证实了AP1S1和TNFRSF11A在LUAD组织中的蛋白表达水平显著升高。
miRNA–mRNA调控对的筛选
使用GEO数据库中的GSE135918数据集（LUAD miRNA表达谱）进行差异表达分析，以正常组织为对照，共鉴定出239个DEmiRNAs，其中136个显著下调，103个显著上调。通过TarBase和miRTarBase数据库获取经实验验证的miRNA-靶标相互作用，将测序数据和公共数据集得到的DEmiRNAs与预测靶标取交集，建立了高置信度的调控轴。交叉验证确定了两个miRNA–mRNA调控对：hsa-let-7a-5p/AP1S1和hsa-let-7b-5p/AP1S1。生存分析表明，hsa-let-7b-5p的低表达和AP1S1的高表达与LUAD患者OS缩短显著相关。功能模型提示hsa-let-7b-5p/AP1S1调控轴可能通过抑制M2巨噬细胞浸润来改善患者预后。随后的NAhybrid分析揭示了hsa-let-7b-5p在靶基因AP1S1的3′非翻译区（3′UTR）内有一个高亲和力结合位点。基因集富集分析（GSEA）显示AP1S1相关基因在p53信号通路上调中显著富集。
miR-let-7b-5p抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移
将miR-let-7b-5p模拟物转染进A549和H1299细胞后，发现其增殖受到显著抑制，且具有时间依赖性。Ki-67染色证实miR-let-7b-5p模拟物组的NSCLC细胞增殖率明显低于阴性对照组（NC）。流式细胞术凋亡分析显示，转染72小时后，miR-let-7b-5p模拟物组的NSCLC细胞凋亡率显著高于空白对照组和NC组。Transwell迁移实验表明，过表达miR-let-7b-5p显著减弱了NSCLC细胞的迁移能力。此外，在miR-let-7b-5p过表达的情况下，细胞侵袭也被有效抑制。
肺癌来源的外泌体miR-let-7b-5p抑制M2巨噬细胞极化
为研究外泌体是否通过将miR-let-7b-5p从A549细胞转移到巨噬细胞（PMA分化的人THP-1单核细胞）来介导细胞间通讯，将巨噬细胞与PKH67标记的A549来源外泌体共培养48小时。在巨噬细胞内观察到PKH67脂质染料，证实A549外泌体可被转移至巨噬细胞。为验证特异性miRNA转运，使用了转染Cy5标记的miR-let-7b-5p模拟物的A549细胞来源的外泌体进行共培养。双通道荧光成像成功捕获了PKH67膜染料和Cy5-miRNA在巨噬细胞内的共定位。机制验证实验表明，与单独的RNase A处理相比，RNase A与Triton X-100联合处理导致miR-let-7b-5p含量显著降低，证明了外泌体膜结构对其内容物的保护作用。功能实验进一步证明，miR-let-7b-5p模拟物能显著提高巨噬细胞内化的miR-let-7b-5p水平。为研究miR-let-7b-5p在M2表型巨噬细胞极化中的作用，用30 μg/mL A549细胞来源的外泌体处理巨噬细胞。结果显示，与Exo-NC组相比，Exo-miR-let-7b-5p模拟物处理组的巨噬细胞M1极化标志物（CD86, iNOS）显著上调，而M2极化标志物（CD206, Arginase-1, TGF-β, IL-10）显著下调。这些结果表明外泌体miR-let-7b-5p能有效抑制肺癌中的M2巨噬细胞极化。
肺癌来源的外泌体miR-let-7b-5p通过抑制M2巨噬细胞极化显著抑制A549细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）
为研究肺癌外泌体来源的miR-let-7b-5p是否通过抑制M2巨噬细胞极化来抑制A549细胞的迁移和侵袭能力，将不同处理的巨噬细胞与A549细胞共培养。Transwell实验表明，与A549+MExo-NC组相比，A549+MExo-miR-let-7b-5p模拟物组的细胞迁移和侵袭水平均显著降低。Western blot分析显示，与A549+MExo-NC组相比，A549+MExo-miR-let-7b-5p模拟物组的N-钙黏蛋白和波形蛋白的蛋白水平显著降低，E-钙黏蛋白的蛋白水平显著升高。这些发现表明外泌体miR-let-7b-5p通过抑制M2巨噬细胞极化，显著抑制A549细胞的迁移、侵袭和EMT过程。
肺癌来源的外泌体miR-let-7b-5p抑制AP1S1表达
此前通过高通量测序和生物信息学分析确定AP1S1是miR-let-7b-5p的潜在靶标。为验证此相互作用，进行了双荧光素酶报告基因实验，证明肺癌来源的外泌体miR-let-7b-5p通过特异性结合其3′UTR区域（核苷酸序列：AGGCUGGA）来调控AP1S1表达。在野生型AP1S1 3′UTR（WT-AP1S1）报告系统中，miR-let-7b-5p模拟物显著抑制了荧光素酶活性。当结合位点突变（MT-AP1S1）时，这种抑制被完全消除，证实了直接的调控相互作用。Western blot一致地显示，miR-let-7b-5p模拟物处理显著降低了巨噬细胞中AP1S1的蛋白水平。这些结果证明A549细胞分泌的外泌体miR-let-7b-5p能有效抑制巨噬细胞中的AP1S1表达。
作为p53的主要负调控因子，MDM2通过泛素化促进其降解，形成负反馈环路。为进一步验证Exo-miR-let-7b-5p是否通过AP1S1-MDM2/c-MYC-TP53轴调控巨噬细胞极化，检测了巨噬细胞中相关通路蛋白的表达。结果显示，与M+A549-Exo-NC组相比，M+A549-Exo-miR-let-7b-5p模拟物组的MDM2和c-Myc蛋白水平显著降低，而p53蛋白水平显著升高。这些发现共同表明AP1S1/p53轴可能是miR-let-7b-5p调控巨噬细胞功能的关键通路。
肺癌来源的外泌体miR-let-7b-5p对肿瘤细胞增殖和转移的抑制作用
为进一步证明AP1S1和miR-let-7b-5p之间的相互作用，在巨噬细胞中过表达了AP1S1，发现与A549-Exo-miR-let-7b-5p模拟物共处理后，AP1S1过表达（AP1S1-OE）显著抵消了肺癌外泌体miR-let-7b-5p的抑瘤作用。此外，与仅用A549-Exo-miR-let-7b-5p模拟物处理的巨噬细胞相比，同时用A549-Exo-miR-let-7b-5p模拟物和AP1S1过表达处理的巨噬细胞，显著逆转了miR-let-7b-5p对A549细胞的促凋亡作用，并增强了A549细胞的迁移和侵袭能力。这些发现共同证明，A549细胞来源的外泌体miR-let-7b-5p通过抑制AP1S1表达，从而调节TAMs向M2极化，以抑制肿瘤侵袭和转移。
讨论
近年来，EVs因其在肿瘤诊断和治疗方面的巨大潜力而受到广泛关注。研究表明，EVs携带多种生物活性分子，并在肿瘤发生、耐药性发展、免疫逃逸和肿瘤微环境重塑中起关键调控作用。其货物中的miRNAs是一类小的非编码RNA，通过结合靶mRNA的3′UTR诱导翻译抑制或转录后降解，在细胞迁移、分化、凋亡和转化等生物学过程中发挥关键作用。在NSCLC中，miRNAs广泛参与失调过程，其作为重要诊断或预后生物标志物及潜在治疗靶点的作用日益凸显。let-7 miRNA家族被认为是一个肿瘤抑制因子家族，在多种癌症中具有关键调控作用。本研究揭示了miR-let-7b-5p在肺癌来源的外泌体中显著下调，并能抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭。同时，EVs中的miR-let-7b-5p模拟物逆转了M2巨噬细胞的极化，从而抑制了NSCLC细胞的迁移、侵袭和EMT。AP1S1是细胞内囊泡运输的关键调节因子，在癌症发病机制中起关键作用。深入探讨这些分子在肿瘤微环境中的调控机制，不仅有助于阐明肿瘤发生和发展的分子机制，还可能为癌症免疫治疗提供新的诊断和治疗策略。
