《Materials Today Bio》：HOCl and Viscosity Dual-responsive Fluorescent Probe for Accurate Discrimination between Early Hepatocellular Carcinoma and Acute Liver Injury
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本研究针对早期肝细胞癌与急性肝损伤临床鉴别诊断的难题，开发了一种新型脂滴靶向、双通道近红外荧光探针TPA-DCN-TPE。该探针可独立、高灵敏度地监测微环境粘度（红通道，增强1532倍）和次氯酸（绿通道，增强363倍），并通过红绿信号比值（R/G）在体内、体外及组织切片水平清晰区分HCC（高比值）与ALI（低比值），为肝病精准诊断提供了可量化的光学新标准。
肝脏，作为人体代谢和解毒的核心器官，其健康状况至关重要。然而，在全球范围内，肝病的发病率持续攀升，其中肝细胞癌和急性肝损伤因其高死亡率而备受关注。这两种疾病在早期阶段常常表现出重叠的临床症状和生物标志物，使得准确区分它们成为临床实践中的一个巨大挑战。传统的血清学检测和医学影像技术往往在疾病早期显得力不从心，灵敏度或特异性不足，导致误诊或诊断延迟，从而错失最佳治疗窗口。这一迫切的临床需求，呼唤着能够同时、精准监测多种病理特异性生物标志物的新型诊断技术的出现。
荧光探针技术，特别是具有聚集诱导发光特性的近红外有机荧光团，为高对比度的活体成像带来了希望。然而，现有的探针大多只能检测单一参数，缺乏细胞器靶向特异性，且通道间易存在信号串扰，难以满足复杂病理微环境的多重标志物分析需求。值得注意的是，微环境粘度和次氯酸的爆发是肝病进展中两个关键但病理生理意义迥异的事件。HCC的微环境以异常的脂质积累和代谢重编程为特征，表现为粘度显著升高；而ALI则由剧烈的氧化应激驱动，导致突出的HOCl爆发。单独监测任一参数均不足以可靠区分二者，但将两者结合，通过其相对变化模式——即粘度与HOCl的信号比值——则能转化出独特的、疾病特异性的“指纹”。这正是发表于《Materials Today Bio》上的这项研究旨在解决的核心问题。
研究人员设计并合成了一种名为TPA-DCN-TPE的新型AIE近红外双通道荧光探针。该探针采用D-A-D'（给体-受体-给体）推拉电子结构，整合了具有AIE特性的三苯胺和四苯基乙烯单元，使其具有脂滴靶向能力和深组织穿透的近红外发射。其关键创新在于正交的双通道响应架构：一个通道通过限制分子内旋转机制对粘度产生高达1532倍的红光增强响应；另一个通道则通过HOCl特异性氧化裂解探针分子中的双氰基乙烯基，产生363倍的绿光开启响应。这两个通道的信号相互独立，无光谱串扰。
为开展研究，作者运用了多项关键技术方法：通过有机合成方法构建了TPA-DCN-TPE分子；利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、高分辨质谱和核磁共振波谱系统表征了探针的光物理性质和HOCl响应机制；通过密度泛函理论和自然跃迁轨道计算从理论层面阐明了探针的粘度/HOCl响应机理；在Huh-7肝癌细胞系中通过共定位实验验证了探针的脂滴靶向能力，并建立了外源性（油酸诱导）和内源性（尼斯特菌素/莫能菌素诱导）粘度升高模型、脂多糖诱导的炎症模型以及Erastin诱导的铁死亡模型，进行双通道活细胞成像；最后，利用Huh-7细胞异种移植瘤小鼠模型和乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤小鼠模型，通过小动物活体成像系统、离体器官成像和组织切片荧光分析，评估探针在体区分HCC与ALI的能力。所有动物实验均遵循浙江人民医院动物伦理委员会批准的实验方案。
3.1. 探针TPA-DCN-TPE的设计与合成
研究团队旨在开发一种能同时、高信噪比检测微环境粘度和HOCl波动，并具脂滴靶向能力的荧光探针。TPA-DCN-TPE采用D-A-D'型推拉电子结构，其高疏水性（logP = 7.77）驱动其特异性靶向脂滴。AIE特性确保探针在脂滴疏水核心聚集时荧光显著激活，同时具有优异的光稳定性。粘度响应机制基于限制分子内旋转，而HOCl响应则通过氧化裂解DCN基团实现，该反应会破坏共轭体系，导致荧光蓝移。
3.2. 光物理性质及对粘度的响应
TPA-DCN-TPE在固态显示最大发射波长在671 nm的近红外发射。在四氢呋喃/水混合溶剂中，当水分数达到90%时，荧光强度增强约283倍，证实其AIE特性。在不同极性的溶剂中，探针表现出明显的正溶剂化色效应，表明其具有显著的分子内电荷转移特性。更重要的是，探针对粘度表现出极高的敏感性，在高粘度甘油中荧光增强达1532倍，且荧光强度与甘油分数呈良好线性关系。选择性实验表明，探针对粘度的响应不受多种潜在干扰物影响，且在宽pH范围和长时间监测下保持稳定。理论计算揭示了其粘度敏感性的分子起源：激发态下显著的几何结构重排和HOMO-LUMO能隙减小，使其荧光对分子运动高度敏感。
3.3. 对HOCl的响应及检测机制
TPA-DCN-TPE对HOCl表现出高选择性，在548 nm处有约363倍的荧光开启响应，检测限低至0.23 nM，且抗干扰能力强。机制研究表明，HOCl特异性氧化裂解DCN基团中的C=C双键，生成羰基衍生物TPA-CO-TPE。理论计算进一步证实，该氧化反应显著降低了分子的电子接受能力，削弱了ICT效应，导致荧光开启和蓝移。
3.4. 脂滴靶向及粘度可视化
细胞毒性实验表明探针生物相容性良好。共定位实验证实TPA-DCN-TPE能特异性靶向脂滴。在外源性和内源性诱导的粘度升高细胞模型中，探针的红通道荧光信号均呈现显著增强，证明其能有效监测活细胞内脂滴微环境的粘度变化。
3.5. 细胞内HOCl、炎症及铁死亡的动态过程监测
探针能够浓度依赖性地检测外源性HOCl。在脂多糖诱导的炎症模型和Erastin诱导的铁死亡模型中，探针的双通道成像显示，炎症和铁死亡过程均伴随细胞内HOCl水平升高和粘度增加，且铁死亡过程中的信号增强可被抑制剂Fer-1挽救。这证实了TPA-DCN-TPE能同时、实时可视化铁死亡相关的两个关键事件。
3.6. 体内诊断可视化
在HCC异种移植瘤和APAP诱导的ALI小鼠模型中，活体、离体及组织切片水平的双通道荧光成像均显示，病变组织相比正常组织有显著的荧光开启。关键区别在于信号模式：HCC病变表现为“红>绿”（粘度响应占主导），而ALI组织表现为“绿>红”（HOCl响应占主导）。定量分析显示，HCC的红色信号增强更为显著，而ALI的绿色信号增强更突出。通过计算红绿信号强度比值（R/G），发现在所有成像水平上，HCC的R/G比值均显著高于ALI，从而建立了一个清晰的成像鉴别标准（HCC: R/G > ~1.5; ALI: R/G < ~0.8）。这种差异性的双参数信号模式为区分这两种临床表现相似的肝病提供了分子基础。
该研究成功开发了一种集脂滴靶向、AIE-NIR光学特性与正交双参数传感于一体的新型荧光探针TPA-DCN-TPE。它不仅实现了对微环境粘度和HOCl的高灵敏度、高选择性检测，以及活细胞中铁死亡和炎症过程的实时监测，更重要的是，通过其产生的独特双参数信号模式（R/G比值），在多个层次上清晰、可靠地区分了早期肝细胞癌和急性肝损伤。这项工作超越了单参数检测的局限，为解决肝病早期精准鉴别诊断这一临床难题提供了一种强有力的分子成像新策略，并为进一步研究代谢性和炎症性疾病中细胞器特异性微环境提供了通用平台。其成功的关键在于将病理生物学的深刻理解（HCC与ALI微环境的内在差异）创新性地转化为可量化的光学读数，为未来临床转化奠定了坚实基础。
