《Microbiological Research》：Natural product honokiol exerts anti-methicillin resistant
Staphylococcus aureus infection activity by targeting pyruvate kinase to inhibit glucose metabolism
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本研究证实天然化合物 honokiol（HNK）通过双重抑制目标酶 PYK 的活性及基因转录，有效阻断 MRSA 的糖酵解及三羧酸循环，显著抑制生物膜形成，降低炎症因子并促进伤口愈合，同时生物相容性良好，为新型抗MRSA药物设计提供依据。
Jingwen Bai|Jinjin Zheng|Chi Wei|Bin Yu|Jingwen Sun|Ziyang Feng|Yu Yang
中国东北农业大学艺术与科学学院，哈尔滨150030
摘要
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的全球传播迫切需要新的治疗策略。本研究证明，天然双酚化合物honokiol（HNK）是一种针对MRSA（包括临床分离株）的强效广谱抑制剂。HNK表现出快速的杀菌活性，能有效破坏生物膜，并在鼠脓肿模型中显著促进伤口愈合，同时降低促炎细胞因子，具有优异的生物相容性。通过整合多组学、生化和生物物理学方法，我们确定丙酮酸激酶（PYK，糖酵解的最终酶）是其主要作用靶点。值得注意的是，HNK采用双重靶向策略，同时抑制PYK酶活性并下调pyk基因的转录。分子对接、动力学模拟和计算突变实验阐明了其精确的结合模式并验证了关键相互作用残基。这种协同作用引发了灾难性的代谢级联反应：严重阻碍糖酵解过程，损害三羧酸循环（TCA循环），导致ATP/NADH大量消耗和氧化应激，最终导致细菌死亡和毒力减弱。我们的发现不仅揭示了一种新的抗菌机制，即同时抑制代谢枢纽的转录和功能，还为药物设计提供了结构基础，使HNK成为对抗多重耐药葡萄球菌感染的有价值先导化合物。下一步的关键是通过对PYK作为关键靶点的遗传验证来推进这一治疗策略。
引言
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的全球快速传播已成为一个重大的公共卫生问题，由于其对传统抗生素的耐药性，导致治疗选择有限（Lakhundi和Zhang，2018；Seo等人，2025）。现有抗菌剂的效力下降凸显了开发新治疗策略的迫切需求，尤其是针对细菌关键代谢途径的策略（Wu等人，2025）。天然产物历来是抗菌化合物的宝贵来源，提供了具有强大生物活性的多种化学结构（Hussain等人，2021）。其中，从木兰属植物中提取的honokiol（HNK）表现出广泛的药理特性，包括抗炎和抗癌作用（Rauf等人，2021）。然而，其作为抗菌剂的潜力，尤其是对抗MRSA的潜力，尚未得到充分研究（Sun等人，2023）。
最近的研究表明，靶向破坏细菌的核心代谢途径，特别是糖酵解和三羧酸（TCA）循环，可以显著削弱细菌的生存能力和毒力（Potter等人，2020；Zheng等人，2023）。例如，在金黄色葡萄球菌中，通过剥夺葡萄糖或酶阻断抑制糖酵解会导致ATP耗尽、毒力因子（如α-溶血素）合成减少以及生物膜形成减弱（Ricci等人，2020）。同样，在铜绿假单胞菌中，通过突变抑制柠檬酸合成酶会降低致病性并增强对抗生素的敏感性（Meylan等人，2017）。这些代谢途径对MRSA尤为重要，因为MRSA在感染和抗生素压力下依赖高效的糖酵解和TCA循环活动来维持其高代谢需求（Potter等人，2020）。然而，关于HNK通过靶向糖酵解和TCA循环抗MRSA机制的研究仍然较少。丙酮酸激酶（PYK）是一种关键的糖酵解酶，催化糖酵解的最终步骤（磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸），在细菌能量代谢中起核心作用（Manuel等人，2021；Schormann等人，2019）。PYK活性直接影响TCA循环的流量、氧化还原平衡（NADH/NAD?比率）以及细胞壁成分（如肽聚糖）和毒力因子的生物合成（Chen等人，2023；Gao等人，2016）发现，在布鲁氏菌中，PYK缺失突变体在鼠模型中表现出严重的生长缺陷和毒力降低。因此，PYK可能成为抗菌药物开发的潜在靶点。鉴于MRSA依赖糖酵解来快速适应宿主环境和抗生素压力，系统评估天然化合物HNK对MRSA的抗菌特性和机制至关重要。
因此，首先通过MIC/MBC测定（包括标准菌株和临床分离株）、时间杀菌动力学、生物膜抑制和膜损伤成像来确定HNK对MRSA的抗菌特性。随后，利用蛋白质组学和酶学测定方法确定丙酮酸激酶（PYK）为主要靶点，qPCR证实pyk基因的转录下调。然后通过综合生物物理技术（BLI、ITC、CETSA）和计算模拟（包括结合模式分析和计算机突变）严格验证了HNK与PYK的相互作用。此外，在体外实验中证明了其与传统抗生素的协同作用以及较低的耐药性发展风险。最后，在鼠MRSA脓肿模型中证实了HNK的体内治疗效果和优异的生物相容性。这项工作全面阐述了HNK的药理和机制特性，证明它是一种新型的多功能抗MRSA剂，通过双重抑制策略靶向PYK，为未来的治疗开发提供了前景。
材料与试剂
纯度为98%的honokiol（HNK）购自Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd.（中国西安）。限制性内切酶（XbaI、BamHI、NcoI）、比色酸（BCA）、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）、细菌基因组DNA提取试剂和SDS-PAGE凝胶制备试剂盒由Jiancheng Bioengineering Institute（中国南京）提供。结晶紫购自Aladdin（中国上海）。所有用于检测PYK、SDH、LDH、ATP、NADH和ROS的试剂盒均购自...
HNK在体外对MRSA表现出强效活性
HNK对MRSA ATCC 43300的最低抑菌浓度（MIC）为20 μg/mL，而对临床分离株SA-01和SA-02的MIC值分别为40 μg/mL和20 μg/mL（图1A）。此外，HNK的最低杀菌浓度（MBC）为40 μg/mL（图1B）。时间杀菌曲线显示HNK对MRSA具有快速抗菌活性（图1C）。与万古霉素相比，HNK的耐药突变频率更低（图1D）。HNK与其他化合物的协同实验结果...
HNK强效抗MRSA活性的讨论
HNK对MRSA ATCC 43300的MIC值为20 μg/mL，表明其活性优于某些已报道的天然化合物（如异戊二烯类黄酮，MIC为32 μg/mL）（Zuo等人，2017）。值得注意的是，HNK对临床分离株也表现出一致的有效性，SA-01和SA-02的MIC值分别为40 μg/mL和20 μg/mL，与标准菌株ATCC 43300相当。这些结果表明HNK的抗MRSA活性...
结论
本研究证明天然化合物HNK是一种强效且有前景的抗MRSA剂。我们发现HNK在低浓度下就能迅速发挥杀菌作用，破坏生物膜，并在体内有效促进伤口愈合，同时具有优异的生物相容性。通过多组学和多种技术方法，我们确定PYK是其主要作用靶点。计算模拟（包括分子对接和丙氨酸扫描突变）进一步明确了其精确的结合模式...
CRediT作者贡献声明
Chi Wei：方法学、数据管理。Bin Yu：软件、方法学。Jingwen Bai：方法学、资金获取。Jinjin Zheng：撰写——初稿、数据管理。Yu Yang：撰写——审稿与编辑。Jingwen Sun：方法学、研究。Ziyang Feng：研究。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32172916）、国家生猪产业技术体系子项目（CARS-35–001）以及东北农业大学学生创新培训计划（S202510224072）的财政支持。
