《Microchemical Journal》：CRISPR for next-generation point-of-care molecular diagnostics
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CRISPR技术为便携式快速诊断提供高灵敏度解决方案，涵盖疾病检测、食品安全、环境监测及可穿戴设备应用，兼具操作简易性和设备自由特性。
Jinyu Fu|Jiaming Yang|Shuobo Shi|Zhenglin Zhu|Xing Wang|Yaru Li
北京先进软物质科学与工程创新中心，北京化工大学生命科学技术学院，中国北京100029
摘要
即时检测（POCT）对于快速疾病诊断至关重要，尤其是在资源有限的环境中。尽管分子诊断方法具有高灵敏度，但现有平台在便携性、可扩展性和准确性方面仍存在显著瓶颈，这限制了其在分布式医疗系统中的应用。本文重点介绍了基于CRISPR的技术作为下一代POCT框架的变革潜力。我们详细阐述了CRISPR诊断的基本原理，该技术利用可编程的Cas蛋白和引导RNA（gRNAs）来识别特定的核酸。这些系统通常结合等温预扩增技术（如RPA、LAMP）以提高灵敏度，随后通过Cas蛋白介导的目标识别和目标激活的信号检测（如荧光、比色法、侧向流动检测）实现无需设备的可视化结果解读。此外，我们还探讨了基于CRISPR的POCT在临床诊断、食品安全、环境污染物检测以及可穿戴设备等领域的广泛应用。CRISPR诊断方法凭借其操作简便性、高灵敏度和多样的信号输出方式，有望推动即时检测的快速、准确和普及。
引言
全球医疗保健领域越来越依赖于快速、准确且易于获取的诊断测试，以指导临床决策、管理疾病爆发并在资源有限的环境中提供医疗服务。即时检测（POCT）已成为这一趋势的基石，它通过将检测直接从集中式实验室转移到患者身边（无论是在诊所、药店、救护车还是家中）来填补关键的诊断空白[1]。全球对POCT的需求反映了其在缺乏适当设备地区的诊断延迟缩短方面的潜力，并涵盖了临床诊断、食品安全、环境污染物检测和可穿戴健康监测等广泛的应用领域。建立有效的POCT检测方法需要综合性的方法，世界卫生组织（WHO）提出了ASSURED标准（经济实惠、灵敏度高、特异性强、用户友好、检测速度快、无需设备且能直接交付给最终用户）来指导这类检测方法的开发[2]。
基于核酸（DNA/RNA）的分子诊断方法是识别传染病、基因变异和癌症生物标志物的金标准[3]。然而，目前的POCT分子诊断平台在便携性、可扩展性和准确性方面存在关键技术瓶颈。例如，现有的等温扩增技术（如RPA、LAMP、RCA）在序列特异性、假阳性率和诊断灵敏度之间存在 trade-offs[4]。直接测序方法虽然分辨率高，但受到昂贵仪器、耗时程序和临床应用灵敏度不足的限制[5][6]。迫切需要工程化解决方案来克服这些限制，而基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的技术正成为下一代生物传感和分子诊断的变革性框架。这里的“下一代”指的是基于CRISPR的系统，它们通过实现仪器轻量化、快速检测和高特异性检测，克服了传统方法（如qPCR）在中心实验室使用的局限性——这是分布式POCT的关键。
基于CRISPR的系统能够在无需目标预扩增的情况下，以飞摩尔级别的灵敏度直接检测特定的核酸单核苷酸多态性（SNPs），达到并超过临床诊断的阈值[8]。当与等温扩增技术（如重组酶聚合酶扩增RPA）结合使用时，这些技术的灵敏度可低至飞摩尔级别[9]。最重要的是，基于CRISPR的检测方法与肉眼可读的信号生成平台（如侧向流动检测[10]和荧光报告分子[11]）的集成，为下一代POCT检测方法的发展展现了巨大潜力。除了核酸检测外，CRISPR技术的最新进展还扩展了其应用范围，包括金属离子、小分子、代谢物和蛋白质等非核酸目标[12]。这种扩展依赖于将特定非核酸分析物的存在转化为合成核酸介质，从而激活CRISPR系统产生可检测的输出。这大大增强了基于CRISPR的平台的诊断灵活性。
目前，基于CRISPR的系统在POCT方面表现出独特的优势，包括操作简便性、可扩展的制造性以及高灵敏度和特异性，推动了多种检测方法的快速发展。基于我们团队在基于CRISPR的生物传感器和等温扩增技术用于快速病原体检测方面的持续研究[11][13]，本文首先阐明了基于CRISPR的生物传感的基本原理，详细介绍了从目标预扩增到CRISPR相关（Cas）蛋白介导的识别以及可视化信号输出的整个流程。接着，我们比较了关键Cas效应因子的操作特性，以评估它们在特定诊断场景中的适用性。此外，本文还概述了快速扩展的应用领域，包括检测传染病和癌症突变、确保食品安全、监测环境污染物以及与可穿戴设备集成以实现持续监测。最后，我们讨论了当前面临的挑战和未来发展方向，包括新型Cas蛋白的发现与工程化、将CRISPR检测方法与智能系统和数字健康平台集成，以及实现转化所需的监管和伦理考量。
部分摘录
基于CRISPR的POCT工作流程和操作模块
基于CRISPR的分子诊断方法利用可编程的Cas蛋白和引导RNA（gRNAs）来特异性检测目标核酸。根据效应因子模块的架构，CRISPR-Cas系统主要分为两类：第一类系统使用多蛋白效应因子复合体（如I型、III型和IV型），而第二类系统使用单一的大效应蛋白（如II型、V型和VI型）[14]。尽管两类系统都已被用于诊断应用，
CRISPR系统在POCT中的应用
基于CRISPR的POCT技术现在可以实现低至1拷贝/μL的检测限[7][19]，与实验室中的qPCR相当，同时保持了即时检测的兼容性。此外，非核酸目标可以通过适配体、抗体或酶转化为CRISPR效应因子可识别的核酸信号，而基于CRISPR的信号检测方法（如旁路切割）可以生成可用于非核酸目标检测的可测量信号[12]。因此，基于CRISPR的POCT技术已被广泛应用于结论与展望
基于CRISPR的生物传感技术已成为分子诊断领域的革命性力量，提供了一个强大且可编程的工具包，有效解决了POCT长期存在的挑战[7]。通过将Cas效应因子的序列特异性与等温扩增和用户友好的可视化读数（如侧向流动检测、比色法）相结合，这些系统实现了实验室级别的灵敏度和特异性，而无需依赖复杂的设备
CRediT作者贡献声明
Jinyu Fu：撰写——原始草稿，概念构思。Jiaming Yang：撰写——原始草稿。Shuobo Shi：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，概念构思。Zhenglin Zhu：撰写——审稿与编辑，可视化处理。Xing Wang：撰写——审稿与编辑，方法学设计。Yaru Li：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，项目管理，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国防工业技术发展计划（编号：JCKY2021602B009）的支持。
