《Redox Biology》：Upregulated GBP2 exacerbates Parkinson’s disease pathogenesis by impairing NIX-dependent mitophagy
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本研究针对帕金森病缺乏疾病修饰疗法的现状，揭示了免疫调节蛋白GBP2在帕金森病发病中的新作用。研究人员发现，在帕金森病相关应激下，GBP2通过香叶酰香叶酰化修饰在线粒体积累，直接结合并促进线粒体自噬受体NIX的泛素-蛋白酶体降解，从而抑制线粒体自噬、加剧线粒体功能障碍和多巴胺能神经元丢失。重要的是，应用香叶酰香叶酰化抑制剂GGTI298可有效缓解神经毒性。该研究不仅阐明了GBP2-NIX轴在帕金森病线粒体质量控制中的关键作用，更为帕金森病的治疗提供了新的潜在靶点。
在大脑的黑质区域，多巴胺能神经元的进行性丧失是帕金森病最显著的病理特征。患者表现出典型的运动三联征——运动迟缓、肌肉强直和静止性震颤，但目前以左旋多巴为代表的治疗手段仅能缓解症状，无法阻止或延缓神经退行性变的进程。因此，阐明帕金森病发病的分子机制，对于开发能够改变疾病进程的疗法至关重要。在众多机制中，线粒体功能障碍被认为是帕金森病神经变性的核心环节。线粒体不仅是细胞的“能量工厂”，其功能状态更直接决定着细胞的生死存亡。线粒体自噬，作为一种选择性清除受损线粒体的自我清洁机制，是维持线粒体稳态的关键防线。当这条防线失效时，受损的线粒体不断累积，导致能量危机和氧化应激，最终触发神经元凋亡。
尽管PINK1/Parkin通路是研究最深入的线粒体自噬通路，但在帕金森病患者中该通路常因突变而受损，这使得像NIX（Nip3-like protein X）介导的这类替代性线粒体自噬通路显得尤为重要。NIX是位于线粒体外膜的蛋白，能够直接招募自噬体，启动线粒体清除程序。然而，在帕金森病中，NIX通路是如何被调控的，其功能失调是否以及如何贡献于疾病进展，仍有许多未知。另一方面，鸟苷酸结合蛋白（Guanylate-binding proteins, GBPs）家族，尤其是GBP2，在免疫调节和宿主防御中作用明确，但其在神经系统，特别是在帕金森病中的功能，却鲜有关注。
在这项发表于《Redox Biology》的研究中，崔文奇、王天璐和冯娟团队揭开了GBP2在帕金森病中的“反派”角色。研究人员发现，在帕金森病患者的黑质组织、MPTP诱导的小鼠模型以及MPP+处理或过表达A53T突变型α-突触核蛋白的细胞模型中，GBP2的表达均显著上调。这种上调并非无害的伴随现象，而是驱动疾病进程的关键因素。当研究人员在体内外模型中敲低GBP2后，MPTP/MPP+诱导的运动缺陷、多巴胺能神经元丢失和细胞凋亡均得到显著缓解。机制探索揭示，帕金森病相关应激促进了GBP2的香叶酰香叶酰化修饰，从而驱动其向线粒体聚集。在线粒体上，GBP2利用其大的GTP酶结构域直接“抓住”线粒体自噬受体NIX，并将其送上泛素-蛋白酶体降解的“断头台”，从而抑制了NIX介导的线粒体自噬。相应地，敲低GBP2增强了线粒体自噬，改善了线粒体稳态，并发挥了神经保护作用。这种保护作用可被线粒体自噬的化学抑制剂或NIX的基因敲低所抵消，证明GBP2是通过抑制NIX介导的线粒体自ophagy来发挥其毒性作用的。最具转化价值的是，研究人员使用香叶酰香叶酰化抑制剂GGTI298进行治疗，显著减轻了MPTP诱导的神经毒性。这项工作不仅首次揭示了GBP2在帕金森病线粒体质量控制中的核心作用，更重要的是指明了一条可通过GGTI298进行药理干预的新治疗路径。
为开展此项研究，作者综合运用了多种关键技术方法。研究采用了MPTP诱导的帕金森病小鼠模型和A53T转基因小鼠模型，以及MPP+处理或A53T α-突触核蛋白过表达的SH-SY5Y细胞模型。通过AAV9介导的基因敲低和siRNA转染技术操控GBP2和NIX的表达。利用细胞活力检测、流式细胞术分析凋亡、免疫组化和TUNEL染色评估神经元存活。通过Seahorse能量代谢分析、活性氧检测、线粒体膜电位测量和透射电镜系统评估了线粒体功能与结构。采用免疫共沉淀、 ubiquitination分析和细胞组分分离等技术探究了GBP2与NIX的相互作用及降解机制。并使用了香叶酰香叶酰化抑制剂GGTI-298进行干预研究。
3.1. GBP2 expression is upregulated in PD patients, MPTP-Treated/A53T Mice and MPP+-induced / A53T α-synuclein-overexpressing SH-SY5Y Cells
研究人员首先通过生物信息学分析发现，帕金森病患者黑质中GBP2和GBP6的mRNA表达显著上调。随后在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中得到验证，GBP2的上调最为显著。在慢性模型（A53T转基因小鼠和A53T α-突触核蛋白过表达细胞）中也观察到GBP2的持续上调，表明GBP2的上调与帕金森病病理特异性相关，而非急性应激的短暂反应。
3.2. GBP2 knockdown protects against MPP+/MPTP-induced neurotoxicity in vitro and in vivo
功能实验表明，在SH-SY5Y细胞中敲低GBP2可显著减轻MPP+引起的细胞活力下降和凋亡。在动物水平，通过AAV9在黑质介导GBP2敲低，能有效缓解MPTP诱导的小鼠运动缺陷，保护黑质致密部的酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元，减少细胞凋亡。证明GBP2在帕金森病模型中发挥着促进神经变性的作用。
3.3. GBP2 accumulates in mitochondria and exacerbates mitochondrial dysfunction in MPP+/MPTP-induced PD models
机制探索从亚细胞定位开始。研究人员发现，在MPP+刺激下，GBP2更多地聚集到线粒体。功能上，敲低GBP2改善了MPP+处理细胞的ATP水平、线粒体呼吸功能、线粒体膜电位，并降低了线粒体活性氧水平。在动物脑中，也观察到氧化应激的减轻和线粒体超微结构的改善。表明GBP2通过靶向线粒体并破坏其功能参与帕金森病发病。
3.4. GBP2 knockdown activates NIX-mediated mitophagy to alleviate PD damage
进一步研究显示，GBP2敲低特异性地升高了线粒体自噬受体NIX的蛋白水平以及LC3-II/LC3-I的比值，同时降低了p62和线粒体外膜蛋白TOMM20的水平，而其他线粒体自噬相关蛋白（PINK1, VDAC1, FUNDC1）无变化。免疫荧光显示LC3与线粒体标记蛋白COX-IV的共定位增加。使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1可逆转GBP2敲低带来的保护效应，证明GBP2敲低是通过增强线粒体自ophagy，特别是NIX介导的通路，来发挥神经保护作用的。
3.5. GBP2 directly interacts with NIX via its GTPase domain to modulate NIX stability
为阐明分子机制，研究人员通过数据库分析和ZDOCK模拟预测了GBP2与NIX之间存在高置信度的相互作用，并通过免疫共沉淀和免疫荧光技术在体内外证实了二者的直接结合。结构域映射实验发现，GBP2的大GTP酶结构域（LG domain）是其与NIX结合所必需的。重要的是，在帕金森病模型中NIX蛋白水平下降，而敲低GBP2可阻止这种下降，特别是在线粒体组分中NIX蛋白得以恢复。
3.6. GBP2 mediates NIX ubiquitination and degradation to suppress mitophagy
GBP2并不影响NIX的mRNA水平，但通过环己酰亚胺追踪实验发现，GBP2敲低显著延长了NIX蛋白的半衰期。使用蛋白酶体抑制剂MG132（而非溶酶体抑制剂氯喹）可阻断GBP2敲低引起的NIX蛋白升高。同时，过表达GBP2增强了NIX的泛素化水平。这些结果证明GBP2通过泛素-蛋白酶体途径促进NIX降解。挽救实验表明，同时敲低NIX可逆转GBP2敲低对线粒体自ophagy、线粒体功能、细胞活力和抗凋亡的促进作用，确立了NIX是GBP2下游的关键效应分子。
3.7. Geranylgeranylation is necessary for the mitochondrial accumulation and function of GBP2 and its inhibition confers therapeutic benefit
最后，研究关注了GBP2功能的调控开关。Triton X-114相分离实验表明MPP+处理增加了GBP2的疏水性，提示其脂质修饰增强。GBP2的C末端具有CAAX基序，是香叶酰香叶酰化的靶点。实验表明，无论是药物抑制（GGTI298）还是基因突变（GBP2-ΔCAAX）破坏香叶酰香叶酰化，均会减少GBP2的线粒体定位及其与NIX的相互作用。在动物模型中，GGTI298治疗显著改善了MPTP诱导的运动障碍和多巴胺能神经元丢失，展现了靶向GBP2香叶酰香叶酰化的治疗潜力。
本研究揭示了一条全新的帕金森病发病机制轴：帕金森病相关应激上调GBP2，并通过其香叶酰香叶酰化修饰驱动其在线粒体富集。在线粒体上，GBP2直接结合NIX并促进其泛素-蛋白酶体降解，从而抑制了作为重要替代通路的NIX介导的线粒体自ophagy，导致线粒体质量控制失效、神经元死亡。研究不仅将传统的免疫蛋白GBP2的功能拓展至神经退行性疾病领域，更重要的是阐明了GBP2调控NIX蛋白稳定性的精确分子机制，并验证了靶向GBP2香叶酰香叶酰化（如使用GGTI298）作为一种潜在治疗策略的可行性。这对于理解帕金森病的线粒体病理、开发新的疾病修饰疗法具有重要的意义。
