《Small Methods》：Rapid Generation of Fusable Cell Beads for Multi-Scale Human Living Materials Assembly
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本文报道了一种结合代谢糖工程(MGE)、点击化学与超疏水表面技术的新方法，可快速制备尺寸可控的球形活细胞珠(living beads)。与传统3D细胞球体(spheroids)相比，该技术突破了细胞密度对尺寸的限制，在干细胞、内皮细胞和癌细胞等多种细胞中均展现出更高的细胞活性和更优的细胞铺展形态，同时保留了球体的关键特性（如融合能力和细胞迁移）。该平台为自下而上(bottom-up)组织工程和疾病建模提供了可重复性高、制备快速的替代方案。
1 引言
三维细胞组装体在组织工程和疾病建模应用中具有显著优势。与二维培养相比，这些培养系统能更好地模拟体内组织，因为它们提供了更接近的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，增加了基质的产生，并更好地再现了营养和氧气梯度。在现有的生理相关细胞组装体中，3D细胞球体提供了一个优异的细胞富集模型，因为它能产生仿生结构，类似于组织的3D结构和基质沉积，并广泛应用于癌症研究，因其模拟了肿瘤的3D性质，复制了其微观结构和细胞-细胞接触。
然而，细胞球体仍存在局限性。目前的细胞球体制备需要较长的细胞聚集时间，且高度依赖于细胞类型和所选制备方法。此外，细胞球体的尺寸取决于其包含的细胞数量，这导致了细胞行为和微环境的变化。开发具有均匀尺寸、与初始细胞数量无关、且生产速度更快的球体类似结构，将通过改善细胞-细胞相互作用和提高实验可重复性，极大地促进相关领域的研究。细胞表面修饰工具箱提供了一个有前景的解决方案。通过代谢糖工程进行细胞表面功能化是一种强大的方法，可将化学修饰的糖类似物整合到细胞表面，从而实现对其的精确操控。
受自然启发，超疏水表面被设计用于排斥水，因此被用于制造圆形物体。这些表面已被用于封装细胞和生物分子，因为其化学特性创造了低表面能，可诱导含有货物的液滴形成近乎球形的形状，从而提供更高的封装效率。
本研究采用细胞代谢糖工程与超疏水表面相结合的方法，快速生产球形活体结构，这些结构表现出相关的细胞存活率和生理模拟细胞形态。利用这项技术，假设可以获得可融合的单元，并有可能实现细胞数量和物体尺寸的解耦。研究还通过探索多种细胞类型（包括干细胞、内皮细胞和乳腺癌细胞），或将此类单元置于其他细胞密集平台中的可能性，展示了该技术的多功能性。
2 结果与讨论
2.1 活细胞珠单元的制备与尺寸表征
为了建立活细胞珠单元，研究者探索了代谢糖工程，用于在细胞表面安装叠氮基团，并结合一种修饰有应变炔烃基团（即二苯并环辛炔，DBCO）的透明质酸生物聚合物（人体细胞外基质ECM的一种成分），通过点击化学反应生成活细胞珠。将这种方法与超疏水表面结合，能够快速制备不同人类细胞类型的球形结构活细胞珠。这些人类细胞类型被选为代表一系列生物学行为，包括干细胞和内皮原代细胞，以在基质和血管相关场景中验证该方法，而乳腺癌细胞则用于验证该方法在难以聚集的细胞中的适用性。
通过结合上述策略，成功建立了具有不同细胞密度但尺寸相似的间充质干细胞活细胞珠。对光学对比显微镜图像的分析显示，传统细胞球体的直径和面积依赖于细胞数量，而使用该技术制备的活细胞珠在三种不同细胞密度下均显示出恒定的直径和面积值，表明尺寸与细胞数量无关。此外，活细胞珠的圆形度更接近1（完美圆形），优于通过随机自聚集形成且需要更长时间才能确定形状的细胞球体。该平台展示了更短的组装时间和优于细胞球体的可操作性。
2.2 已建立的活细胞珠与低粘附性表面制备的细胞球体的比较
先前对Cellgel技术的研究表明，代谢糖工程可以在多种细胞类型中成功实施，而不会影响细胞活力和代谢活性。为了进一步验证该平台作为细胞球体的替代性活体单元，通过活/死分析和F-肌动蛋白染色研究了两种结构在14天成熟期内的活力和细胞形态。活/死分析显示，活细胞珠的活力更高，特别是在后期时间点（14天），此时仅在细胞球体中观察到细胞死亡增加。F-肌动蛋白染色表明，与相应的细胞球体相比，活细胞珠内的细胞表现出更典型的细胞形态，脂肪源性干细胞在培养第3天就显示出纺锤形形态和细胞铺展，而这在标准细胞球体中直到培养第14天才能实现。活细胞珠内存在的透明质酸（一种细胞外基质成分）可能为细胞提供了锚定点，RHAMM和CD44受体很可能参与了细胞与束缚生物聚合物之间的连接。结合在这些系统中观察到的细胞运动和迁移，这使得细胞能够向其特征的纺锤状形态铺展。
细胞-ECM相互作用广泛影响和调节细胞行为，包括增殖、迁移或分化等过程。结果表明，活细胞珠内的细胞具有改善的细胞活力和典型的细胞形态，这可能是由于初始存在的ECM成分（即使浓度较低）促进了一个更具生理相关性的3D环境，具有改善的组织样结构和细胞-基质相互作用。
2.3 内皮细胞和乳腺癌活细胞珠的建立与表征
为了进一步研究该方法在各种组织工程和疾病建模策略中的应用潜力，研究者使用其他细胞类型建立了携带细胞的活细胞珠，并将其与相应的细胞球体进行了比较。成功用人脐静脉内皮细胞和乳腺癌MCF-7细胞系生成了活细胞珠，并具有合适的细胞活力。值得注意的是，MCF-7乳腺癌细胞系在使用超低粘附方法时特别难以自聚集并形成有凝聚力的细胞球体。因此，将该方法应用于此细胞类型，旨在提高体外乳腺癌模型的可重复性，从而解决当前细胞球体形成方法学中的一个关键局限性。
研究结果表明，生物正交点击化学方法具有通用性，适用于多种细胞类型。与干细胞类似，它能够生产不同细胞数量但尺寸相似的活细胞珠，而这对于细胞球体是无法实现的。值得注意的是，即使在不易聚集的细胞中，携带细胞的活细胞珠也显示出比细胞球体改善的圆形度值。关于这些结构的活力，在后期时间点（如培养第7天），细胞球体内部（尤其是内皮细胞）出现活力丧失，而活细胞珠则保持较好。对于乳腺癌细胞珠，较低的接种密度与一些细胞损失相关，而以最高密度形成的珠保持了其结构完整性；值得注意的是，这种情况最接近体内观察到的高细胞密度。这些发现证明了该方法能够产生更均匀的细胞聚集体，最终具有改善的生产速度，并形成比标准细胞球体形成技术更易处理的结构。
有趣的是，当用转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231生产活细胞珠时，细胞表现出向周围基质胶Matrigel侵袭的行为。培养第3天即可观察到侵袭，到培养第14天，初始活细胞珠与周围环境之间已无法区分边界，癌细胞完全扩散至整个结构。这些结果表明，该系统保留了嵌入细胞的关键形态和生物学特性，使得能够生产保留相关表型特征的模型。
2.4 通过活细胞珠单元融合建立多尺度人造活材料
细胞球体作为细胞富集结构，能够在接触时融合，创建更大的统一结构。这一特性在自下而上的组织工程中非常有价值，因为它能够创建更复杂的组装体，增强了此类平台的仿生性。此外，较小构建块的融合和跨不同尺度的复杂性不断增加的结构的发展，对于改善机械完整性和功能整合非常重要。近年来，3D生物打印技术使得能够成功打印和融合细胞球体，以创建在结构和 incorporated 细胞类型方面复杂性更高的结构。先前的研究表明，使用此方法生产的人细胞基Cellgels能够在接触时融合和自我愈合。基于此，假设活细胞珠能够融合并创建具有不同几何形状的更复杂的分层结构。
为了验证这一点，将活细胞珠在超低粘附板中接触培养7天。活细胞珠图像分析显示，当放置在一起时，活体单元具有明确的边界。然而，接触7天后，活细胞珠形成了一个无缝的结构，这是由各个构建块融合而成的。F-肌动蛋白染色证实它们成功融合，并创建了具有不同形状的无缝结构。
为了进一步补充共聚焦成像并评估活细胞珠之间的融合程度，对通过将四个活细胞珠在超低粘附板孔中接触培养获得的融合结构进行了磁共振成像扫描。该结构的3D重建证明了其构建块之间的无缝融合。有趣的是，在初始活细胞珠之间没有观察到明显的边界，在整个结构中显示出均匀的模式。这些结果表明，活细胞珠的融合过程产生了一个有凝聚力的、结构均匀的组装体。
为了进一步理解融合过程，测量了培养7天的两个相邻活细胞珠之间的珠间角。相邻活细胞珠之间的角度随着培养时间的增加而增大，表明成功的融合过程导致了活细胞珠之间边缘的不那么明显，从而角度值增加。
为了展示活细胞珠可以融合成更复杂的结构，将活细胞珠在圆形琼脂糖模具内接触培养7天。光学显微镜和F-肌动蛋白染色图像显示活细胞珠成功融合。观察到活细胞珠之间的细胞桥接，细胞延伸穿过融合活细胞珠的连接处，形成连续且有凝聚力的构建体。值得注意的是，在超低粘附板和琼脂糖模具之间没有观察到融合动力学的明显差异，表明自组装过程在很大程度上独立于初始培养平台。在活细胞珠连接处存在富含F-肌动蛋白的细胞桥，进一步表明融合过程中活跃的细胞骨架重塑，可能有助于形成组织样机械性能。
为了研究细胞类型组成对融合过程的影响，开发了具有异型活细胞珠的分层结构，并在琼脂糖模具中接触培养。结果表明，拥有不同细胞类型的活细胞珠并不会阻止这些单元的融合。事实上，不仅发生了活细胞珠的融合，而且细胞还能够桥接并迁移到相邻的活细胞珠中，其中干细胞的迁移增加，众所周知干细胞具有高迁移性，并与内皮细胞相互作用以影响整体细胞迁移。有趣的是，标准细胞球体需要更长的聚集时间，在聚集4小时后一起培养时，每个细胞球体的圆形度较低。此外，可以观察到孔板中有松散的细胞，表明与活细胞珠单元相比，需要更长的聚集时间才能使细胞聚集。在一起培养7天后，细胞球体经历了广泛的融合，最终形成单个团块并失去了其定义的架构。
2.5 活细胞珠保留特征性细胞迁移
细胞迁移是若干病理和生理过程的关键现象，特别是对于组织再生。虽然已经使用2D培养进行了若干伤口愈合研究，通过在细胞单层中创建一个无细胞区域，细胞可以桥接和修复，但细胞大多在3D状态下迁移。3D微环境通过生化物理线索在细胞迁移行为中起着关键作用。细胞球体内的细胞，如间充质干细胞和内皮细胞，当与其他环境（即组织模拟和生物相容性水凝胶）接触时，具有迁移的自由。这种整合周围环境的自由在各种生物场景中起着关键作用，例如有效的组织再生，作为描绘转移和癌症进展等机制的有用疾病模型，甚至对于血管生成等过程。
因此，评估了活细胞珠内细胞向周围组织迁移的能力。为此，以3:1的比例制备了由人脐静脉内皮细胞和人脂肪源性干细胞组成的活细胞珠，并将其置于基质胶中，作为一种组织仿生水凝胶。开发异型活细胞珠是因为已知间充质干细胞对内皮细胞有积极影响，作为支持和诱导血管形成的细胞。进行了活/死测定以评估两种类型细胞的活力，结果显示细胞在培养1天后（当它们被转移到基质胶时）仍然存活。将活细胞珠培养14天，F-肌动蛋白染色结果显示，活细胞珠内的细胞有自由向周围环境迁移。有趣的是，迁移的细胞显示出纺锤状形状，这是干细胞的特征，表明很可能这些细胞与内皮细胞相比具有更高的迁移速率和能力。确实，研究表明间充质干细胞具有高运动性和迁移能力，尤其是在ECM丰富的环境中。这些特征在组织再生和血管生成等过程中至关重要。在后者中，人脂肪源性干细胞在刺激内皮细胞形成血管样结构方面起着关键作用，这一过程很可能涉及内皮细胞的管状形成，并且更可能发生在细胞聚集体附近。
2.6 模块化血管化人造活材料的开发
在组织工程和疾病建模中，纳入血管细胞单元都至关重要，因为它们参与若干生物过程以及结构在组织内的成功整合。因此，将内皮活细胞珠纳入间充质干细胞衍生的Cellgels（通过细胞代谢糖工程与束缚透明质酸生物聚合物相结合产生的细胞富集平台）中，以证明在组织类似物内创建血管化单元的可能性，当植入时允许此类平台的血管化。为了可视化这些活细胞珠在Cellgel内的整合以及内皮细胞的行为，分别用脂溶性染料Vybrant DiD和DiO对人脐静脉内皮细胞和人脂肪源性干细胞进行染色。将四个活细胞珠置于Cellgel前体溶液中，以整合到更大的平台内。血管化单元的共聚焦成像显示这些活细胞珠（红色）与人脂肪源性干细胞Cellgel（绿色）成功整合。此外，可以观察到不仅活细胞珠成功整合，而且到第5天有细胞从内皮活细胞珠迁移到其周围环境，这种迁移在结构成熟14天后更加显著。
生长因子，即血管内皮生长因子，在促进血管生成中起着关键作用，这对于促进工程化组织和生物材料整合到宿主组织中至关重要。研究人员一直在开发具有此类分子受控释放的材料，以实现组织的适当整合和再生。由于该方法可以将内皮细胞活细胞珠整合到人脂肪源性干细胞衍生的Cellgels中，假设通过组合两种细胞类型，包含血管化单元的平台将释放促血管生成因子，为组织工程等应用提供有益特性。因此，对这些结构在成熟第1天和第3天的VEGF进行了ELISA分析，并与不含活细胞珠的Cellgels进行了比较。在成熟第3天，虽然血管化构建体与对照Cellgels相比显示出轻微增加，但差异无统计学意义。已知间充质干细胞产生增强血管生成并促进内皮细胞存活和迁移的生长因子。在共培养时，这些细胞类型建立旁分泌效应，其中内皮细胞上调因子，进而促进间充质干细胞释放促血管生成因子。这在3D共培养时被上调。因此，尽管在测定中VEGF水平没有显著变化，但很可能有其他血管生成介质有助于系统的整体促血管生成潜力。关键参数如嵌入的血管活细胞珠的数量或其细胞密度可以轻松调整。此外，该方法具有高度模块化和适应性，可通过调整细胞类型、密度以及平台的结构组成或提供动态培养条件，使其适用于各种领域。
3 结论
本研究探索了一种通过使用生物正交点击化学结合超疏水表面原位制造来生成球形活细胞珠单元的简单方法，并随后应用于生成多尺度人造活材料。与在低粘附板中生产的细胞球体相比，这些单元在成熟过程中表现出改善的细胞活性和典型的纺锤样细胞形态。有趣的是，可以生产具有不同细胞密度但体积相似的活细胞珠，这是当前细胞球体生产策略无法实现的优势。活细胞珠表现出相关特征，包括融合创建多尺度活体结构的能力，以及向周围组织样基质迁移的能力。该方法的模块化使得既可以为组织工程生产自下而上的结构，也可以将它们整合到其他组织工程平台中，赋予这些平台新的功能或特性。最终，该方法提供了改进的可扩展性和活细胞珠单元的制造时间，为高度受益于活体特征的领域提供了一个有价值的平台。
