新型呼吸疾病诊断技术：基于Au-ReS2功能化扩展栅场效应晶体管适配体传感器同步检测颗粒酶B和穿孔素的研究

《Small Science》：Novel Respiratory Disease Diagnosis Tool: Development of an Au-ReS2-Functionalized Extended-gate Field-Effect Transistor-Type Aptasensor for Simultaneous Detection of Granzyme B and Perforin

本文开发了一种新型扩展栅场效应晶体管（EG-FET）适配体传感器，通过Au-ReS2功能化实现颗粒酶B（GzmB）和穿孔素（PRF）的双重检测。该传感器在10%人血清中10分钟内完成检测，检测限达飞摩尔级别（GzmB 330 fM，PRF 440 fM），可精准反映慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者支气管功能状态，有望替代传统肺功能检查成为呼吸疾病早期诊断新工具。

　　

摘要

传统肺功能检查（Spirometry）受患者主观状态影响，诊断结果可重复性受限。本研究提出一种新型扩展栅场效应晶体管（EG-FET）适配体传感器，通过同步检测颗粒酶B（GzmB）和穿孔素（PRF）实现呼吸疾病局部免疫反应的诊断。新型GzmB和PRF适配体通过指数富集配体系统进化（SELEX）合成并截短以增强靶标结合能力。Au-ReS₂功能化和交流电热流（ACEF）技术分别用于放大生物传感信号和加速检测（10分钟内）。在10%人血清中，传感器随靶标浓度呈现线性响应，双生物标志物与COPD患者支气管状态呈现强临床相关性。

1 引言

细胞毒性T细胞在呼吸疾病免疫过程中起关键作用，其过度激活通过凋亡途径导致组织损伤。GzmB和PRF参与顺序性凋亡通路，作为反映细胞毒性T细胞介导免疫过程的关键生物标志物。本研究构建的EG-FET生物传感器采用微米级双电极传感膜，Au-ReS₂功能化提升低丰度生物标志物检测灵敏度，ACEF技术加速靶标结合过程。

2 结果与讨论

2.1 合成适配体的结合特性

适配体相比抗体具有低免疫原性、高稳定性等优势。截短后的Tr-GzmB和Tr-PRF适配体结合亲和力显著提升（K_d值分别降低43%和37%），分子对接模拟显示高置信度结合模型（置信度>0.95）。双棱镜溶液浸没硅（DP-SIS）传感器验证截短适配体具有更高结合信号。

2.2 EG-FET生物传感系统构建

二硫化铼（ReS₂）具有高比表面积和快速电子转移特性，Au-ReS₂复合物通过金属-半导体界面促进电子传导。传感膜功能化过程中，Au-ReS₂（1 mg mL^-1）和适配体（100 nM）浓度优化后产生最大信号偏移。阈值电压（V_t）变化显示传感器在4°C和25°C下可稳定工作5天，芯片间变异系数<10%。

2.3 体外生物传感性能评估

在10%人血清中，传感器对GzmB和PRF的检测限分别为330 fM和440 fM，线性范围10 pM-1 μM。选择性测试显示传感器对同源蛋白（GzmA、GzmK、C9）和炎症因子（IL-2、IFN-γ、TGF-β、TNF-α、MMP-9）具有显著区分能力（p<0.001）。热图分析证实检测结果的可重复性。

2.4 呼吸疾病临床应用评估

采用COPD患者血浆样本验证临床适用性。GzmB和PRF检测信号与GOLD分级显著相关（p<0.001），双标志物检测在COPD诊断中曲线下面积（AUC）达0.913，对GOLD分级的区分灵敏度90.1%、特异性100%。传感器模块化结构支持传感膜更换，重复使用5次后仍保持稳定性能。

3 结论

本研究开发的EG-FET平台成功实现GzmB和PRF同步检测，克服传统肺功能检查的局限性。截短适配体增强结合亲和力，Au-ReS₂功能化提升检测灵敏度，临床样本验证表明该平台可有效反映支气管功能状态，为呼吸疾病早期诊断提供新技术路径。

4 实验方法

涉及SELEX筛选、适配体截短、Au-ReS₂合成（水热法）、电极功能化（半胱胺/Au-ReS₂/适配体）、EG-FET测量系统构建等关键技术细节。临床样本来自岭南大学医学中心COPD患者队列（IRB 2021-02-053），符合GOLD 2023指南标准。