《Sensors and Actuators Reports》：Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): Current Progress and Future Directions in Rapid Nucleic Acid Detection
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本综述系统梳理了环介导等温扩增（LAMP）技术的最新进展，涵盖从引物设计、核心酶工程、反应体系优化到检测方法创新的全流程。文章重点探讨了LAMP在即时检测（POCT）中的独特优势，如高灵敏度、强抗干扰性及快速可视化检测，并分析了其面临的假阳性、气溶胶污染等挑战。通过整合CRISPR系统、微流控芯片、纳米材料等前沿技术，LAMP正朝着更精准、高效、便携的方向发展，为传染病防控、食品安全及海关检疫等领域提供了强大工具。
环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）是一种在恒定温度（通常为60–65°C）下实现核酸高效扩增的技术。它利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶和一套特异性识别靶序列多个区域（通常为6-8个）的引物（包括内引物、外引物和环引物），无需热循环仪即可在30分钟内将靶核酸扩增数百万至数十亿倍。自2000年Notomi等人发明以来，LAMP因其操作简便、灵敏度高、特异性强、检测时间短以及对抑制物耐受性好等优点，已成为全球研究最广泛的等温扩增技术之一。
LAMP技术的引物设计策略
LAMP的成功高度依赖于精密的引物设计。其引物通常针对靶基因的6个 distinct 区域，包括F3、F2、F1、B1、B2和B3。为了提升扩增速度和灵敏度，还可设计环引物（Loop F和Loop B）。引物设计需综合考虑熔解温度（Tm值，F1c/B1c和环引物为64–66°C，F2/B2和F3/B3为59–61°C）、GC含量（40-65%，优选50-66%）、引物末端稳定性（ΔG ≤ –4 kcal/mol）以及避免形成二级结构。目前常用的引体设计工具包括PrimerExplorer V5、LAVA、GLAPD等，它们各有侧重，如GLAPD可利用全基因组序列进行群体特异性引物设计，而LAMP Designer则整合了BLAST搜索以降低交叉同源风险。
样本预处理方法的优化
样本预处理是保证LAMP检测准确性的关键环节。直接检测法利用LAMP技术对复杂样本中抑制物的耐受性，简化了核酸释放步骤。常用的预处理方法包括：
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热孵育与碱裂解法：简单经济，但热稳定核酸酶可能影响效率，常与其他方法联用。碱裂解（如0.5 M NaOH）效果可与商业试剂盒媲美，但可能干扰pH依赖性显色系统。
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蛋白酶K与表面活性剂：蛋白酶K（如Thermolabile Proteinase K）可水解RNase，与表面活性剂（如SDS、Triton X-100、Tween-20）联用，能有效裂解细胞/病毒膜结构并释放核酸，产生协同效应。
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还原剂与金属螯合剂：如TCEP可破坏蛋白质二硫键，EDTA可螯合Mg2+抑制RNase活性。但过量EDTA可能螯合LAMP反应所需的Mg2+，可使用Chelex-100树脂替代。联用DTT、Chelex-100和热孵育可显著降低检测限。
核心酶的工程化改造与辅助酶的应用
LAMP技术的核心是DNA聚合酶，其性能直接影响扩增效率。
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Bst DNA聚合酶的进化：从去除5′→3′外切酶活性的Bst-LF，到通过计算机设计同源物、融合核酸结合域或进行电荷工程修饰的突变体（如NEB Bst 2.0/3.0/4.0、Br512、Mut235、SC5678等），Bst DNA聚合酶在热稳定性、扩增速度、盐耐受性、抑制剂抗性、dUTP掺入能力（如Bst 5.0可实现100% dTTP被dUTP替代）和逆转录酶活性方面不断优化。
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其他DNA聚合酶：如SD DNA polymerase和OmniAmp polymerase，可在更高温度下反应，抑制引物二聚体形成，提高特异性。
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逆转录酶：用于RNA检测的RT-LAMP。除传统的AMV、MMLV外，HIV来源的逆转录酶及工程化高保真变体（如RTX、SuperScript IV RT）展现出更好的热稳定性和过程性。一些Bst DNA聚合酶突变体（如Bst 3.0）也具备逆转录酶活性。
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辅助酶：尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）可降解含dUTP的残留污染物，防止交叉污染。Tte UvrD解旋酶可抑制非模板扩增。RNase抑制剂可保护RNA模板。DNase I用于去除RNA样本中的DNA污染。此外，Tth Endonuclease IV、T7E I、RNase HII等也被用于提高检测特异性或实现信号转换。
LAMP反应增强剂的应用
反应增强剂可从灵敏度、反应效率和降低假阳性三个方面提升LAMP性能。
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灵敏度增强：如盐酸胍可提高灵敏度；锁核酸（LNA）修饰的分子信标可增强热稳定性，降低背景。
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反应效率提升：甜菜碱（Betaine）可降低GC丰富模板的Tm值，但浓度需优化；牛血清蛋白（BSA）可稳定酶活性，但过量可能因分子拥挤效应降低产量；海藻糖（Trehalose）可增强酶热稳定性；L-脯氨酸（L-proline）可降低序列Tm值并提高聚合酶稳定性。
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假阳性抑制：聚乙烯二醇-纳米氧化石墨烯（PEG-nGO）可吸附多余引物，减少非特异性起始；疏水性磁性离子液体（MIL）可浓缩DNA并释放抑制引物二聚体的金属离子。
多样化的检测方法学
LAMP扩增产物或副产物的检测方法多样，各具特色。
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琼脂糖凝胶电泳：可观察到阶梯状条带，但操作繁琐，气溶胶污染风险高，现多用于区分非特异性扩增。
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比色法：利用反应过程中pH下降（酚红等染料从粉红变黄）或Mg2+浓度变化（羟基萘酚蓝HNB从紫变蓝，钙黄绿素-锰复合物荧光恢复）。还有基于焦磷酸酶水解PPi生成磷酸，再与钼酸铵形成磷钼蓝复合物，或基于精胺-二氧化硅-炭黑颗粒导致胶体溶液从黑色不透明变为透明上清液的方法。新型染料LSV、LSM颜色对比度更佳。
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浊度法：通过实时监测镁焦磷酸盐白色沉淀导致的浊度变化，但稳定性短暂。
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侧向流动层析（LFD）：利用预置抗体检测带有生物素、地高辛等标记的扩增产物，可通过胶体金显色。可实现多重检测，但开管稀释步骤有污染风险。集成化的“一次性核酸检测装置”可降低此风险。
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荧光染料：SYBR Green I、GeneFinder、SYTO系列（如SYTO 9、82）、Eva Green等DNA嵌入染料可实现实时或终点荧光检测。不同染料对扩增的抑制作用和信号背景比不同。
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淬灭探针（Q Probe）：探针与靶序列杂交时，荧光被序列中的鸟嘌呤淬灭，荧光信号随扩增进行而降低，产生倒S型曲线。
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生物发光法（BART）：利用扩增产生的焦磷酸离子（PPi）在ATP硫酸化酶催化下生成ATP，进而触发荧光素酶发光，实现实时检测。
LAMP与其他技术的集成
技术集成旨在提升LAMP的性能和应用范围。
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CRISPR-Cas系统：LAMP扩增后，CRISPR-Cas12a/Cas13a对产物进行特异性识别并触发反式切割活性，切割报告分子产生强信号，极大提高特异性，可实现可视化检测。需解决温度兼容性（如使用耐热Cas12b或修饰引物降低反应温度）、Mg2+消耗和pH变化对Cas酶活性的影响。
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纳米材料：金纳米颗粒（AuNPs）可作为信号标记（如LFD）或反应增强剂（提供热启动效应）。功能化AuNPs（如MUA-AuNPs）可通过螯合Mg2+导致颜色变化。金纳米棒（GNRs）也可用于比色检测。
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数字检测：包括芯片式数字LAMP和微滴式数字LAMP。将反应体系分割成数千至数百万个独立单元进行平行扩增，通过计算阳性单元比例实现绝对定量，灵敏度可达单分子水平，但设备要求高。
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RPA/RCA联合：RPA或RCA快速生成模板，再由LAMP高效放大信号，适用于短片段或低丰度靶标检测，但引物设计和反应条件优化复杂。
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微流控技术：实现样本处理、核酸扩增、结果检测的集成化和自动化，降低污染，提高通量和便携性。有基于硅/玻璃的传统芯片和纸基芯片（2D/3D结构）。
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智能设备控制：智能手机/平板与LAMP系统结合，通过定制APP、LED光源、摄像头和机器学习算法，实现便携、低成本、高通量的实时荧光或比色检测与结果判读。
LAMP技术的常见问题与解决方案
LAMP技术的主要挑战包括假阳性和假阴性。
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假阳性：主要源于非特异性扩增（尤其是引物二聚体）和气溶胶污染。解决方案包括优化引物设计、添加DMSO等增强剂、使用UDG防污染系统、严格分区操作。
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假阴性：常由反应抑制（样本复杂成分抑制Bst酶活性）或引物设计不佳导致。可通过样本稀释纯化、添加BSA、优化引物和验证灵敏度来改善。
标准与最佳实践
目前LAMP相关标准主要集中于食品检测领域（如ISO 24914）。医疗IVD领域的LAMP产品在欧美主要通过现有医疗器械监管框架（如欧盟IVDR、美国FDA 510(k)或EUA）进行规范。
总结与展望
LAMP技术作为一种强大的等温核酸扩增工具，在POCT领域展现出巨大潜力。未来的发展将集中于解决假阳性和气溶胶污染、简化引物设计、提高自动化程度。通过深度融合CRISPR、微流控、纳米材料、数字PCR和智能设备等技术，LAMP将朝着更高特异性、灵敏度、多重检测能力、便携性和用户友好性的方向演进，在基层医疗、现场筛查、家庭自测、环境监测等领域发挥更重要的作用。下一代分子POCT设备将更加微型化、多功能集成化，推动实验室精准诊断向现场即时需求的普及。
