《Separation and Purification Technology》：Beyond electrostatic adsorption: Zr-functionalized magnetic nanoparticles achieve selective and enhanced small RNA extraction from Bacteria and plasma
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短非编码RNA高效分离纯化新方法——基于Zr-O-P配位键的磁性纳米颗粒开发及其性能验证。
刘佳琪|陈向宇|冯雪|郑佳宇|史超|李勇|马翠萍
青岛科技大学生物工程学院，中阿联合病原微生物快速检测国际合作实验室，青岛快速核酸检测重点实验室，青岛快速核酸检测工程技术研究中心，中国青岛市266042
摘要
短链非编码RNA（包括microRNA和细菌小RNA）在真核和原核系统中都起着关键的调节作用，并且作为生物标志物和治疗靶点具有巨大潜力。然而，从复杂样品中高效分离这些RNA仍然具有挑战性。传统的RNA提取技术（如硅胶柱或氨基修饰的磁珠）依赖于静电吸附，容易受到盐分干扰和非特异性结合的影响，导致短链RNA的回收率较低。在此，我们开发了锆功能化的磁纳米颗粒（Zr@MNPs），通过特定的Zr-O-P配位键选择性捕获RNA。Zr@MNPs对RNA具有高亲和力，在生理条件下不会吸附DNA。经过系统优化后，该方法对20–63个核苷酸长度的短链RNA的回收率超过了85%。在总RNA提取方面，Zr@MNPs在产量、纯度和完整性方面与商业试剂盒相当。但在细菌小RNA和血浆microRNA提取中，Zr@MNPs的产量是商业试剂盒的2–3倍。本研究提出了一种快速、高效且无有机溶剂的RNA提取方法，特别适用于短链RNA分析，在实验室研究和临床诊断中具有广泛的应用前景。
引言
RNA，尤其是短链非编码RNA分子（如microRNA（miRNA）和细菌小RNA（sRNA），在生物过程中起着关键的调节作用。它们不仅是疾病诊断中有前景的生物标志物和潜在的治疗靶点[1]，还在合成生物学中的微生物致病性和精密调控网络中发挥核心作用[2][3]。深入探索和转化这些下游应用高度依赖于从复杂生物样品中高效且特异性地分离高质量的RNA。因此，开发一种能够快速、选择性分离和纯化RNA（特别是短链RNA）的技术已成为推动相关研究领域突破的关键步骤。
尽管现有的RNA提取技术很多，包括使用有机溶剂的液相提取（如Trizol）[4][5]、使用硅胶膜旋转柱的固相提取（如Qiagen RNeasy试剂盒）[6]或基于静电吸附的磁珠（如Dynabeads? Oligo (dT)）[7]已成为标准实验室方法，但这些方法在面对日益复杂的研究需求时存在固有的局限性。例如，基于静电吸附的方法（利用正电荷基团如氨基）在高离子强度或复杂样品基质中容易受到干扰，并且对分子量小、电荷密度低的RNA片段（sRNA <200个核苷酸）的亲和力较弱，导致其在处理过程中通过非特异性结合或无效吸附而大量丢失，从而显著降低回收率[8][9]。此外，在全血、组织或细菌裂解物等高度复杂的样品中，共存的污染物（如基因组DNA、蛋白质、脂质和多糖）会与目标RNA竞争结合位点或形成物理屏障。即使经过DNase消化和多次洗涤，也难以完全去除这些污染物，最终影响RNA的纯度和产量。此外，传统方法使用苯酚和氯仿等有毒有机试剂，操作繁琐、耗时且难以适用于高通量应用。因此，当前领域的挑战在于开发一种既能高效选择性捕获RNA（特别是短链RNA），又能提供类似磁分离的操作便利性和良好经济可行性的吸附材料。
近年来，研究人员开始关注利用金属离子与核酸分子之间多种特异性相互作用的创新材料。其中，金属有机框架（MOFs）由于其可调的孔结构、高比表面积和不饱和的金属位点，在核酸吸附和分离方面表现出独特优势[10][11]。这种机制不仅限于金属离子（如锌、铁或铬）与磷酸骨架之间的简单配位，还可能包括孔内尺寸筛选效应、π-π堆叠或有机配体与核酸碱基之间的氢键等协同作用（详见综述[12][13]）。这些相互作用比单一的静电吸附提供了更高的选择性。例如，基于锌的MOFs（如ZIF-8）已被用于DNA的装载和递送，显示出对核酸的强亲和力[14]。某些基于锆（Zr）的MOFs（如UiO-66）已被证明能高效捕获磷酸化肽和核苷酸，这归因于Zr与磷酸基团之间形成的稳定双配位[15][16]。然而，目前关于基于金属的材料的研究主要集中在DNA固定或检测平台上，而对它们区分不同类型核酸（如DNA、sRNA或miRNA）的能力的系统研究相对较少。
基于基于锆的材料在富集磷酸化分子方面的潜力，我们在这里描述了一种新型的锆功能化磁纳米颗粒（Zr@MNPs）用于RNA提取。本文主要研究了其吸附性能、关键影响因素以及其在选择性RNA结合方面的作用机制，特别是从复杂样品中高效回收小RNA的效果。本研究的目的是试图填补关于这种基于金属的材料在选择性核酸分离应用方面的知识空白，为下一代高性能RNA提取技术的发展提供理论基础。
材料与试剂
羟基修饰的磁珠（MNPs，50 mg/mL）购自Biomag Biotechnology Co., Ltd.（中国无锡）。大肠杆菌菌株（E. coli, ATCC 8739）由青岛科技大学保存，用于基因组RNA提取。RNAprep Pure Bacterial (DP430)和Blood (DP433) RNA提取试剂盒购自Tiangen Biotech Co., Ltd.（中国北京）。TransZol Up Plus RNA试剂盒（ER501–01-V2）和EasyPure Blood RNA提取试剂盒也用于实验。
Zr@MNPs的制备与表征
为了开发新型RNA吸附剂，我们在pH 2.0条件下将MNPs与ZrOCl?·8H?O耦合成功制备了Zr@MNPs（图1A）。原子力显微镜（AFM）表征显示，与未修饰的MNPs相比，Zr@MNPs的粒径显著增大（图1B）。进一步的形态分析表明，MNPs的平均粒径、波度和粗糙度分别为0.87 nm、0.48 nm和0.17 nm，而Zr@MNPs的这些值分别增加到16.5 nm、14.3 nm和3.1 nm。
结论
在本研究中，我们成功制备了锆功能化的磁纳米颗粒（Zr@MNPs），并证明了它们能够高效选择性地提取RNA，尤其是小RNA。吸附机制主要归因于Zr4+与RNA骨架中的磷酸基团之间的配位，在生理条件下稳定，但在碱性洗脱条件下可逆。
CRediT作者贡献声明
刘佳琪：方法学研究、数据分析。陈向宇：方法学研究。冯雪：验证工作。郑佳宇：数据分析。史超：验证工作、概念构思。李勇：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、资金获取、数据分析、概念构思。马翠萍：撰写-审稿与编辑、项目监督、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了山东省自然科学基金（ZR2023MC166、ZR2023QD125）项目的资助。
