一种基于FRET（荧光共振能量转移）的比率荧光探针，可用于选择性检测肼、进行活体成像以及实现便携式传感

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A FRET-based ratiometric fluorescent probe for selective hydrazine detection, live imaging, and portable sensing

本工作开发了一种基于FRET系统的联氨荧光探针系列，其中RC-n-Bu因高灵敏度（k2=49.4 M?1·min?1）、低背景水解和优异选择性成为最优探针，成功应用于活细胞成像、斑马鱼模型及便携式试纸开发。

　　

舒琪唐|洪达吴|一峰韩

摘要

肼（N₂H₄）是一种有毒的工业化合物，需要灵敏且选择性的检测方法。我们报道了一系列基于FRET系统的比率荧光探针（RC-Ac、RC-Pr、RC-n-Bu、RC-i-Bu），这些探针结合了香豆素和罗丹明荧光团。其中，RC-n-Bu表现出最佳性能，具有最小的背景水解和较高的二级反应速率常数（k₂ = 49.4 M^?1·min^?1）。RC-n-Bu在接触肼后显示出明显的比率荧光变化，从而实现了精确的定量和优异的选择性。它已成功应用于活细胞和斑马鱼成像，并且便携式试纸格式允许在紫外光下通过智能手机辅助分析进行视觉检测。这项工作为生物和环境中的肼监测提供了一个多功能平台。

引言

肼（N₂H₄）是一种高反应性和有毒的小分子，广泛用于航空航天推进、制药、农用化学品和聚合物合成[1]。其强烈的亲核性和还原性质使其在工业应用中不可或缺，但这些特性也对人类健康和环境构成严重威胁[2]。肼暴露与肝毒性、神经毒性和肾毒性以及致癌性有关[3]。它可以诱导DNA甲基化和氧化损伤，并被美国环境保护署（USEPA）列为可能的人类致癌物，该机构为饮用水中的肼设定了严格的阈值限制，为10 ppb[4]。这些担忧突显了迫切需要灵敏、选择性和实用性的肼检测方法，尤其是在复杂的生物和环境基质中。

传统的检测技术，如气相色谱-质谱（GC–MS）[5]、高效液相色谱（HPLC）[6]、电化学传感器[7]和分光光度法[8]，虽然准确度高，但通常受到高成本、耗时的样品制备以及不适合实时或体内监测的限制。相比之下，荧光探针因其操作简单、高灵敏度和与活细胞及体内成像的兼容性而成为强大的替代方案[9]、[10]、[11]、[12]。其中，比率荧光探针特别有利，因为它们通过测量两个波长下的发射强度比来进行内部校准，从而最小化了环境和仪器干扰[13]、[14]、[15]、[16]。

在过去十年中，基于多种识别策略（如腙的形成、环的开环和环闭合反应以及脱保护机制）开发了多种对肼有响应的荧光探针[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。其中，基于酰基的脱保护策略，特别是使用醋酸酯、4-溴丁酸酯和二羧亚胺基团的策略，因其设计简单和对肼的可靠反应性而受到广泛关注[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]、[49]、[50]、[51]、[52]、[53]、[54]、[55]、[56]、[57]、[58]、[59]。这些方法利用肼的亲核性来触发键断裂并产生可测量的光学信号。然而，许多现有探针存在缺点，如高背景水解[60]、有限的生物相容性[61]、不理想的比率对比度[62]或不足以实现实时检测的动力学性能[63]。此外，实现对结构相似胺类的强选择性和开发便携式、现场可部署的格式仍然是持续的挑战。

为了解决这些限制，我们报道了一系列基于F?rster共振能量转移（FRET）系统的比率荧光探针（RC-Ac、RC-Pr、RC-n-Bu和RC-i-Bu），该系统结合了香豆素（供体）和罗丹明（受体）荧光团（图1）。通过在罗丹明的羟基上引入不同空间位阻的酰基，我们设计了能够选择性断裂和调节荧光的肼响应基团。通过对水解稳定性和肼触发断裂动力学的系统评估，我们确定了RC-n-Bu为最佳探针，其在肼作用下的背景水解最小，二级反应速率常数（k₂ = 49.4 M^?1·min^?1）理想。

在接触肼后，RC-n-Bu的比率荧光从470 nm（香豆素）明显转移到548 nm（罗丹明），从而实现了精确定量。我们进一步证明了其在活HeLa细胞和斑马鱼中对肼的比率荧光成像中的实用性，证实了其生物相容性和成像保真度。为了将其应用扩展到现场诊断，我们开发了一种含有RC-n-Bu的纸质荧光试纸。在365 nm紫外光照射下，试纸显示出明显的颜色变化，红色与蓝色（R/B）荧光比值与肼浓度之间存在强烈的线性关系，并且对生物胺类具有优异的选择性。

这项工作不仅扩展了肼响应荧光探针的工具箱，还提供了FRET框架内基于酰基识别基团的结构-活性关系（SAR）分析。通过结合动力学优化、比率成像和便携式检测格式，RC-n-Bu为生物和环境中的肼监测提供了一种全面且多功能的策略。

章节片段

2′-氯-3′-羟基-6′-(哌嗪-1-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9′-蒽]-3-酮（6

将化合物5（1 g，3.42 mmol）和3-羟基苯哌嗪（600 mg，3.42 mmol）混合在三氟乙酸（20 mL）中，在氮气氛围下于95°C搅拌7小时。冷却至室温后，将反应混合物倒入甲基叔丁基醚中，得到红色固体的沉淀。通过过滤收集固体，并从甲醇中重结晶得到化合物6（1 g，产率67%）。¹H NMR（400 MHz，CD₃OD）δ 8.08–8.03 (m, 1H), 7.80

RC-R探针（RC-Ac、RC-Pr、RC-n-Bu、RC-i-Bu）的合成

RC-R探针是通过图2中概述的多步骤路线合成的。合成策略包括构建一个基于FRET的支架，该支架由香豆素供体和罗丹明受体组成，然后通过各种酰氯进行酰基化以生成对肼有响应的识别单元。合成始于在60°C下甲醇中2、4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛、2-二甲基-1,3-二氧杂环丁烷-4,6-二酮和L-谷氨酸的缩合

结论

总之，我们开发了一系列基于FRET系统的比率荧光探针（RC-Ac、RC-Pr、RC-n-Bu和RC-i-Bu），用于选择性地检测肼。通过调节酰基识别单元的空间和电子性质，我们确定了RC-n-Bu为最佳候选者，它具有优异的水解稳定性、快速的反应动力学（k₂ = 49.4 M^?1·min^?1）和稳健的比率荧光响应。该探针对

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了浙江省自然科学基金（授权号：LY17B070008）的支持。