HSPA1A-BAG5 伴侣复合物通过促进 ATF2 的泛素化介导的降解来促进精子发生

《Tissue and Cell》：HSPA1A-BAG5 Chaperone Complex Promotes Spermatogenesis by Driving Ubiquitination-Mediated Degradation of ATF2

HSPA1A通过调控BAG5-ATF2泛素化降解机制维持精子发生，抑制凋亡并促进增殖，其功能缺失导致睾丸萎缩和精子质量下降，为男性不育治疗提供新靶点。

　　

温州医科大学衢州附属医院，衢州市人民医院，生殖医学中心，中国浙江省衢州市

摘要

背景

男性不育是一个全球性的健康挑战。热休克蛋白A1A（HSPA1A）是一种应激诱导的分子伴侣蛋白，在精子发生过程中可能起着重要作用，尽管其确切的机制作用尚未明确。

方法

通过对人类精子转录组数据（GSE6969）的分析，发现HSPA1A在正常精子样本和不育精子样本中的表达存在差异。功能表征包括在精原细胞（GC-1 spg）中过表达HSPA1A，并在精细胞（GC-2 spd(ts)）中敲低HSPA1A，评估其对细胞凋亡、增殖和细胞周期进程的影响。通过免疫沉淀-质谱法鉴定与HSPA1A相互作用的蛋白质，并通过共免疫沉淀进行验证。下游靶点通过生物信息学分析和蛋白质组学进行研究。体内验证使用了慢性HSP70抑制的小鼠模型（VER-155008）。

结果

HSPA1A在正常精子中高表达，其过表达显著抑制了细胞凋亡，增强了细胞增殖，并诱导了S/G2期停滞；而HSPA1A的敲低则产生了相反的效果。BAG5被确定为HSPA1A的主要相互作用蛋白。机制上，HSPA1A-BAG5复合物促进了ATF2的泛素化介导的降解，从而下调了凋亡信号通路。体内实验表明，HSPA1A的抑制会导致睾丸萎缩、精子数量减少、精子形态异常、生精小管结构破坏以及生殖细胞凋亡增加。同时观察到ATF2和p53的表达上调，以及睾酮水平下降。

结论

HSPA1A-BAG5复合物通过依赖泛素化的ATF2降解来维持精原细胞的存活和增殖。这些发现揭示了一个对精子发生至关重要的新调控轴，并将HSPA1A定位为治疗男性不育的有希望的治疗靶点。

引言

生殖健康对于人口延续至关重要。然而，全球约有8%-12%的夫妇受到不孕症的影响，其中近一半病例由男性因素导致（Cavalhas-Almeida等人，2025年；Hosseini等人，2024年）。在男性不育的原因中，精子质量受损是一个主要因素，通常表现为精子数量减少、活动力下降和形态异常（Carson和Kallen，2021年；Jiao等人，2021年）。尽管关于精子发生和精子发育的研究已经取得进展，但调控这些过程的分子机制仍不完全清楚。

热休克蛋白（HSPs）是一类保守的分子伴侣蛋白，通过促进新生多肽的折叠、调节蛋白质复合物的组装和拆卸，并在生理和应激条件下通过泛素-蛋白酶体途径指导错误折叠的蛋白质重新折叠或降解来维持细胞蛋白稳态（Jacob等人，2017年；Zininga等人，2018年）。HSP家族成员根据功能分为组成型和非诱导型：组成型HSPs维持基础蛋白稳态，而非诱导型HSPs在细胞应激时被激活。在各种HSPs中，70-kDa亚组（HSP70s）因其功能多样性和组织特异性而受到特别关注（Rosenzweig等人，2019年；Singh等人，2024年）。值得注意的是，HSP70s在包括小鼠、牛和人类在内的多个物种的睾丸和精子中高表达，并参与重要的生殖功能，如精子发生、精子成熟和受精（Dix等人，1996年；Kamaruddin等人，2004年；Miller等人，1992年）。HSP70家族成员1 A（HSPA1A）是一种主要的诱导型成员，在氧化应激、热应激或毒性应激下迅速上调（Finka等人，2015年；Wu等人，2021年）。它在成熟精子表面和精原细胞中被检测到，表明其可能参与精子发生和男性生殖功能（Liao和Tang，2014年；Rosyada等人，2022年）。

Bcl-2相关凋亡基因5（BAG5）是BAG蛋白家族中的一个独特成员，具有五个串联的BAG结构域。BAG5通过调节自噬、泛素-蛋白酶体系统和凋亡途径来维持细胞蛋白稳态（Chung和Dawson，2004年；Gupta等人，2022年；Li等人，2021年）。此外，作为共伴侣蛋白，BAG5通过与HSP70的ATP酶结合（特别是通过其第五个BAG结构域BD5）来发挥作用（Arakawa等人，2010年）。这种相互作用诱导HSP70的构象变化，增强其蛋白质折叠活性（De Snoo等人，2019年）。最近的研究表明，BAG5通过确保精子头尾连接装置（HTCA）中结构蛋白的正确折叠参与男性生育能力；BAG5敲除的小鼠表现出HTCA紊乱和完全不育（Gan等人，2024年）。

激活转录因子2（ATF2）是一种转录因子，参与凋亡、DNA损伤反应和细胞分化的调控，主要通过翻译后修饰实现，如c-Jun N末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化（Reimold等人，2001年；Shah等人，2010年）。尽管ATF2在多种组织中都有功能，但其在精子发生中的调控作用尚不清楚。

因此，本研究的核心目的是确定HSPA1A和BAG5在精原细胞中是否存在功能相互作用，并探讨这种相互作用可能的下游后果，包括其对ATF2等转录因子的影响，特别是在男性不育的背景下。

实验方法片段

免疫荧光（IF）实验

将细胞接种到24孔板的无菌盖玻片上。细胞粘附后，用4%的戊二醛固定20分钟。随后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，并用5%的牛血清白蛋白（BSA，Solarbio，中国，A8020）封闭2小时。对于双免疫荧光染色，细胞与两种不同宿主物种产生的初级抗体混合物孵育。去除未结合的初级抗体后

HSPA1A在正常精子中高表达并促进精原细胞增殖

鉴于HSPA1A在精子发生和维持男性生殖功能中的潜在作用（Domingos等人，2013年；Eddy，1999年；Kumar等人，2020年），我们分析了来自基因表达组学数据库（GEO）（GSE6969）的正常（正常）和不育精子样本中的HSPA1A表达水平。结果显示，HSPA1A在正常组中的表达显著高于不育组（图1A；p = 0.0098）。为了全面研究HSPA1A

讨论

本研究揭示了一个先前未被认识到的分子轴，即HSPA1A与共伴侣蛋白BAG5结合，通过靶向泛素化和降解促凋亡转录因子ATF2来调控精原细胞的存活和增殖。我们的发现确立了HSPA1A作为精原细胞发育的关键调节因子，并揭示了一种依赖于蛋白稳态的机制，该机制直接将伴侣蛋白活性与凋亡通路的抑制联系起来

结论

总之，我们的研究揭示了一个新的HSPA1A-BAG5-ATF2轴，通过该轴HSPA1A促进健康的精子发生。HSPA1A在正常精子中高表达，并通过抑制凋亡信号通路来维持精原细胞的增殖。机制上，HSPA1A-BAG5复合物增强了ATF2的泛素化介导的降解，从而在精原细胞中促进增殖和抗凋亡表型（图7）。这一轴对于正常的生精小管结构至关重要

伦理批准声明

本研究的动物实验遵循了ARRIVE指南和“动物护理和使用指导原则”（中国），并获得了衢州市人民医院动物伦理与福利委员会的批准（批准编号：QZRMYY-20250626-001）。

利益冲突声明

作者声明没有潜在的利益冲突。

资助

本研究得到了浙江省衢州市科学技术局的资助（编号：2021Y012）。

CRediT作者贡献声明

彭毅：撰写——原始草稿、方法学、数据管理、概念构思。彭博：软件、方法学、数据管理。曹颖：正式分析、数据管理。傅向红：撰写——审稿与编辑、方法学、概念构思。

利益冲突声明

作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：彭毅报告称获得了浙江省衢州市科学技术局的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。