BMAL1在TDCIPP诱导的HT22细胞自噬和凋亡中的调控作用

《Toxicology》：The regulatory roles of BMAL1 in TDCIPP-induced autophagy and apoptosis in HT22 cells

TDCIPP通过调控BMAL1和AMPK/mTOR通路介导HT22细胞自噬与凋亡，揭示了新型神经毒性机制。

刘宇|梁若萱|徐本宏

深圳现代毒理学重点实验室，深圳市健康毒理学医学重点学科（2020-2024年），深圳市疾病预防控制中心，中国深圳518055

摘要

三（1,3-二氯-2-丙基）磷酸酯（TDCIPP）是一种常见的有机磷酸酯阻燃剂，广泛用于各种消费品中，并已成为一种环境污染物。近期研究记录了TDCIPP的神经毒性作用，强调了其促进神经元凋亡和诱导自噬的能力。然而，其背后的调控机制仍不甚明了。本研究观察到，在TDCIPP处理的小鼠HT22细胞中，Brain and Muscle ARNT-Like 1（BMAL1）的表达上调，表明BMAL1可能在TDCIPP诱导的神经元自噬和凋亡中起关键作用。此外，通过Western blot（WB）和流式细胞术（FACS）分析探讨了BMAL1敲低对TDCIPP诱导的HT22细胞自噬和凋亡的影响。结果表明，TDCIPP暴露调节了BMAL1和自噬相关蛋白的表达水平，并增加了mTOR的磷酸化。BMAL1表达的抑制导致AMPK表达下降，从而阻断了细胞自噬。总体而言，这些结果突显了BMAL1通过AMPK信号通路在TDCIPP诱导的HT22细胞死亡机制中的作用。因此，本研究为TDCIPP诱导的HT22细胞神经毒性机制提供了新的视角和证据。

引言

三（1,3-二氯-2-丙基）磷酸酯（TDCIPP）是一种新型阻燃剂，广泛应用于家具、电子设备、纺织品和其他家用产品中（Li等人，2017年；Percy等人，2020年；Stapleton等人，2012年；Van Der Veen和De Boer，2012年）。由于其广泛应用和不稳定性质，TDCIPP在产品老化过程中会释放到空气中，导致广泛的环境暴露（Ding等人，2016年；Stapleton等人，2012年）。因此，在包括中国、美国和英国在内的多个国家的室内环境中检测到了相对较高的TDCIPP浓度（Percy等人，2020年；Wang等人，2021年）。除了室内环境外，TDCIPP还存在于地表水、灰尘和生物样本中（Bollmann等人，2012年；Bradman等人，2014年；Hallanger等人，2015年；Shi等人，2016年；Zhang等人，2020年）。此外，吸入、皮肤吸收和摄入是人类吸收TDCIPP的主要途径（Hou等人，2016年）。此外，在人类生物样本中检测到了TDCIPP及其代谢物，包括尿液（Hou等人，2016年；Qin等人，2021年）、血液（Wang等人，2020年）、母乳（Kim等人，2014年；Sundkvist等人，2010年）和胎盘（Ding等人，2016年）。越来越多的流行病学和实验研究表明，TDCIPP暴露对人体神经系统、内分泌系统和生殖系统具有不同程度的毒性作用（Killilea等人，2017年；Moser等人，2015年；Li等人，2018年）。例如，一项体外研究（Li等人，2023年）显示TDCIPP在分化的PC12细胞中诱导神经毒性。此外，TDCIPP还被证明会影响斑马鱼早期胚胎的神经发育和幼体畸形（Dishaw等人，2014年）。另一项使用斑马鱼模型的研究（Li等人，2018年）表明TDCIPP具有生殖发育毒性。另外，TDCIPP通过增强内质网（ER）应激并激活与线粒体凋亡相关的通路，在SH-SY5Y细胞中诱导凋亡（Li等人，2017年）。动物研究还表明，TDCIPP暴露会降低小鼠（15–150 mg/kg）和斑马鱼（10–100 μM）的神经行为反应（Dishaw等人，2014年；Moser等人，2015年）。尽管上述研究对TDCIPP暴露的毒性作用有所启示，但其各种毒性作用背后的机制仍不清楚。

自噬是一种生理性的细胞自我降解过程，通过该过程细胞可以清除受损的细胞器、蛋白质和其他细胞成分，以维持正常的细胞稳态和功能（Mari?o等人，2014年；Zhu等人，2024年）。相关研究（Brooks等人，2023年；Ding等人，2024年；Tang等人，2024年；Wang等人，2024年）表明，自噬在细胞生长、发育、应激反应和疾病（如癌症、神经退行性疾病等）中起着重要作用。值得注意的是，多项研究报道了自噬与TDCIPP暴露产生的毒性作用之间的关系。例如，Li等人（2023年）表明，DNA损伤诱导转录因子4（DDIT4）在TDCIPP诱导的PC12细胞自噬和凋亡中起调节作用。此外，Li等人（2017年）的细胞实验研究表明，TDCIPP通过ROS介导的AMPK/mTOR/ULK1通路诱导自噬和凋亡。另一项近期研究（Zou等人，2024年）提出，TDCIPP暴露可能通过影响自噬相关过程促进阿尔茨海默病（AD）的发展。

BMAL1是一种关键的生物钟调节因子，参与维持生理节律、代谢健康和免疫稳态，在许多疾病的发展中起关键作用（Liu等人，2024年；Schrader等人，2024年；Zeng等人，2024年）。一项动物研究（Zou等人，2024年）表明，TDCIPP暴露显著影响BMAL1蛋白表达。同时，McKee等人（2023年）的最新研究表明，BMAL1蛋白影响星形胶质细胞自噬和内溶酶体功能，表明BMAL1参与自噬相关过程。然而，BMAL1在TDCIPP处理的HT22细胞中的具体机制和意义仍不清楚。

因此，本研究的总体目的是调查和揭示BMAL1在TDCIPP诱导的HT22细胞自噬和凋亡中的调节作用。Western blot分析和蛋白质组学实验显示，暴露于TDCIPP的HT22细胞中自噬相关蛋白发生了变化。同样，在BMAL1敲低后也检测到了自噬和凋亡相关蛋白的变化。最后，使用流式细胞术确认了BMAL1在TDCIPP诱导的HT22细胞凋亡中的作用。总体而言，我们的数据表明BMAL1在TDCIPP诱导的HT22细胞自噬和凋亡中起关键作用。这些发现为TDCIPP暴露引起的神经毒性提供了新的视角。

部分摘录

化学品

纯度≥98%的TDCIPP购自Macklin Reagent（中国上海）。串联质量标签（TMT）标记试剂盒购自Thermo Scientific（美国新泽西）。测序级胰蛋白酶/Lys-C混合物购自Promega（美国威斯康星）。在二甲基亚砜（DMSO，纯度≥99.7%，Sigma-Aldrich，美国）中制备了1 mol/L的TDCIPP储备溶液，并在实验使用前进行系列稀释以获得工作溶液。每种处理中的最终DMSO浓度均低于

TDCIPP暴露改变了HT22细胞中的BMAL1表达水平

动物实验显示，暴露于TDCIPP后BMAL1表达上调。因此，本研究使用HT22细胞系进行了体外实验。Western blot分析的结果表明，15 μmol/L的TDCIPP处理显著上调了BMAL1的表达水平（图1A和B）。此外，使用了不同浓度的TDCIPP（0、5、15、45或60 μmol/L）来研究其对HT22细胞的剂量效应关系。如图1所示，

讨论

暴露于TDCIPP会在海马神经元细胞系HT22中诱导自噬和凋亡，表明其具有潜在的神经毒性。我们之前的研究表明，TDCIPP暴露显著上调了大鼠大脑中BMAL1蛋白的表达水平（Zou等人，2024c）。本研究显示，在暴露于15 μM TDCIPP的HT22细胞中BMAL1表达上调，而在45 μM浓度下则下调。为了探讨BMAL1的作用

结论

总之，低剂量TDCIPP暴露在HT22细胞中增强了自噬并上调了BMAL1表达。此外，BMAL1敲低显著阻断了TDCIPP诱导的自噬并促进了凋亡，表明BMAL1在TDCIPP诱导的自噬和凋亡中起关键作用。此外，BMAL1敲低并未显著改变mTOR的磷酸化水平，但显著抑制了AMPK信号通路。因此，本研究提供了新的

作者贡献声明

刘宇：撰写——原始草稿、软件、方法学、数据分析、概念化。徐本宏：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、方法学、资金申请、数据分析、概念化。梁若萱：软件、方法学、研究、数据分析、概念化。

伦理批准和参与同意

不适用。

资助

本项目得到了深圳市医学研究资金（B2303006）、深圳市科技计划（JCYJ20220530172608018）、广东省医学研究基金（资助编号A2025053）、深圳市重点医学学科建设基金（SZXK069）以及深圳市医学项目（SZSM201611090）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

无