《Vaccine》：Bromelain-cleaved hemagglutinin production from cell culture-derived influenza viruses enhances vaccine potency quantification by single radial immunodiffusion assay
编辑推荐：
优化细胞培养来源流感病毒BHA制备及抗原-抗体匹配对SRID效价检测准确性的影响。采用分步酶解策略提升A/H3N2和B/Victoria毒株BHA纯度及产量，并证实同源抗原-抗体组合较异源或蛋源系统提高HA定量精度达15%-30%，为细胞基流感疫苗标准化检测提供新方案。
Ohseok Jeong | Wooyoung Choi | Hyebin Ahn | Seonghyun Lee | Yong Wook Park | Hun Kim | Jae-Hwan Nam
SK Bioscience生物研发部门，韩国城南13494
摘要
单径免疫扩散（SRID）测定法仍是确定流感疫苗效力的金标准。准确的SRID测定需要高纯度的抗原和与流行病毒高度匹配的株特异性抗血清。然而，在传统的基于鸡蛋的系统中共育的流感病毒会发生突变，从而影响抗原性和测定准确性。因此，我们优化了从细胞培养来源的流感病毒中生产菠萝蛋白酶切割的血凝素（BHA），特别针对A/H3N2和B/Victoria谱系菌株。我们采用了一种顺序酶解策略，成功制备出了高纯度的BHA，其抗原产量更高，神经氨酸酶污染最小。所得抗血清表现出强烈的株特异性反应。后续的SRID测定证实，从细胞培养材料中获得的同源抗原-抗血清组合比异源或基于鸡蛋的组合提供了更准确的血凝素定量结果。这些发现强调了匹配抗原和抗血清来源的必要性。此外，细胞培养来源的试剂可以提高测定可靠性，推动基于细胞的流感疫苗生产中的标准化和质量控制。通过证明抗原-抗血清匹配的重要性并优化从细胞培养来源的流感病毒中生产BHA，本研究为提高基于SRID的效力测试的可靠性和推进下一代流感疫苗的标准化奠定了实用基础。
引言
流感继续构成重大的全球健康挑战，这推动了每年生产和分发有效疫苗的需求。现代流感疫苗包括灭活病毒疫苗、减毒活疫苗以及最近使用的重组蛋白疫苗[1]。评估疫苗效力至关重要，以确保每剂疫苗含有足够的活性抗原以引发免疫反应[2]。单径免疫扩散（SRID）测定法仍是量化流感疫苗中关键免疫原蛋白血凝素（HA）含量的金标准[3]。准确的SRID性能从根本上取决于精确校准的抗原和具有高特异性的株特异性抗血清的可用性。菠萝蛋白酶切割的血凝素（BHA）通常被用作生产抗血清的抗原[4]。流感HA的三维结构首次在一项开创性研究中得到阐明，该研究表明菠萝蛋白酶处理去除了跨膜结构域，同时保留了免疫学上关键的外部区域[5]。这支持了BHA作为抗原的有效性，使其高纯度生产对于保持一致的免疫原性和可靠的测定结果至关重要。
尽管传统基于鸡蛋的流感疫苗生产系统已使用多年，但它存在诸多挑战。在鸡蛋中培育的流感病毒常常在其HA和神经氨酸酶（NA）蛋白中积累适应性突变（例如氨基酸替换），这会改变其抗原性与流行野生型菌株的差异[6]。这些变化通过降低疫苗抗原与流行病毒之间的匹配度来削弱疫苗的有效性[7]。更重要的是，它们还会影响SRID测定中HA定量的准确性。虽然一些研究报道对于某些菌株（如H7N9）生产平台对HA定量的影响很小[8]，但对于其他菌株（如H3N2）观察到了显著差异，其中适应鸡蛋的突变与人类免疫保护力的下降有关[9][10][11]。这些差异凸显了基于鸡蛋的试剂的固有限制，以及迫切需要能够准确反映流行病毒抗原性的替代品。
因此，基于细胞培养的流感疫苗生产成为了一个有前景的替代方案，提供了更好的抗原保真度。与在鸡蛋中传代的菌株不同，在Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞悬浮液中培育的流感病毒通常在多次传代后表现出更高的遗传稳定性，尽管仍可能偶尔发生HA或NA的突变[12]。这支持了越来越多的共识，即细胞培养来源的抗原更接近野生型病毒[10,13]，可能在动物模型中引发更广泛的交叉反应性抗体反应和更好的保护作用[14,15]。因此，无论是来自鸡蛋还是细胞培养的抗原和抗血清的来源，都可能显著影响基于SRID的HA定量准确性。这突显了预先验证这些来源的必要性，以确保可靠的疫苗标准化[16]。
我们的目标是解决改进基于细胞的流感疫苗效力测试所需的高纯度抗原和抗血清试剂的关键问题。我们专注于优化从细胞培养来源的A/H3N2和B/Victoria谱系菌株中生产高纯度BHA。为此，我们开发了一种针对细胞培养来源病毒独特特性的改进的两步酶解方法，旨在提高BHA的纯度和产量。生成高质量的BHA并评估其在SRID测定中的表现，将大大有助于推进基于细胞培养的流感疫苗生产领域的标准化和质量控制框架。
部分内容片段
细胞系和病毒
MDCK细胞（ATCC CCL-34）被适应于悬浮和无血清条件，并用于病毒培养。流感病毒株A/Texas/50/2012（H3N2亚型）和B/Brisbane/60/2008（B/Victoria谱系）来自维多利亚传染病参考实验室（VIDRL；澳大利亚墨尔本）。这两种菌株都是细胞培养来源的病毒。
SRID标准
SRID测定的参考抗原来自国家生物标准与控制研究所（NIBSC），包括
从A/H3N2亚型病毒优化BHA制备
为了使用细胞培养来源的A/H3N2病毒株生成用于标准抗血清生产的高纯度BHA，我们根据WHO合作中心协议和相关文献优化了影响BHA产量的关键参数（图1A；补充表1）。关键变量包括2-巯基乙醇浓度、菠萝蛋白酶浓度、反应时间和温度。使用细胞培养来源的A/Texas/50/2012菌株进行的初步实验评估了
讨论
在这项研究中，我们成功优化了从细胞培养来源的流感病毒中生产高纯度BHA，并证明了当抗原和抗血清来源匹配适当时，SRID测定可以提供准确的效力测量结果。此外，我们确认了细胞培养来源的病毒种子库的遗传稳定性，并强调了抗原-抗血清兼容性对于可靠抗体测定的重要性，这使它们区别于基于鸡蛋的系统。
CRediT作者贡献声明
Ohseok Jeong：写作 – 审阅与编辑、撰写初稿、方法学、数据分析、概念化。Wooyoung Choi：方法学、数据分析。Hyebin Ahn：写作 – 审阅与编辑、数据分析。Seonghyun Lee：写作 – 审阅与编辑。Yong Wook Park：写作 – 审阅与编辑、监督。Hun Kim：写作 – 审阅与编辑、撰写初稿。Jae-Hwan Nam：写作 – 审阅与编辑、撰写初稿。
作者贡献
Ohseok Jeong（O.J.）设计了细胞培养实验，准备了图表，分析了数据，并起草了手稿。Wooyoung Choi（W.C.）参与了实验设计并协助数据解释。Hye-Bin Ahn（H.-B.A.）协助了数据分析和手稿准备。Seonghyun Lee（S.L.）审阅并编辑了手稿。Yong Wook Park（Y.W.P.）监督了整个研究并作为通讯作者提供了关键修改。Hun Kim
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了韩国食品药品安全部（MFDS）的资助，项目编号为18172 传染病响应251（Y.W.P.）、22213MFDS421和RS-2025-02213409（J.H.N.），并部分得到了Brain Korea 21 Plus计划的支持。该项目最初授予SK Chemicals，随后在2018年该公司疫苗部门分拆后由SK Bioscience继续进行。资助方未参与研究设计、数据收集或分析过程。
