使用滴液数字PCR技术对自然感染犬只中埃立克体（Ehrlichia canis）的细菌载量进行纵向评估

《Veterinary Microbiology》：Longitudinal assessment of Ehrlichia canis bacterial load in naturally infected dogs using droplet digital PCR

犬单核细胞增多症（CME）患者经多西环素治疗后，检测Ehrlichia canis DNA血症的动态变化。比较ddPCR与qPCR的敏感性及定量效果，发现ddPCR在基线（82.92%）和30天（57.14%）检测率均显著高于qPCR（60.97%和9.52%），且细菌载量从2.28 copies/μL降至0.067 copies/μL（P<0.05）。严重贫血犬在30天时ddPCR阳性率更高（P=0.035）。该研究证实ddPCR对低载量检测更优，但需结合存活率检测明确持续DNA血症的临床意义。

　　

Peeravit Sumpavong|Krittanut Kanittakul|Sarawan Kaewmongkol|Gunn Kaewmongkol

泰国曼谷卡塞萨特大学兽医技术学院兽医技术系

摘要

在使用多西环素完成整个疗程后，仍能检测到Ehrlichia canis DNA的持久性现象的研究较少。高灵敏度的分子检测工具对于监测这一现象至关重要。本研究旨在通过滴液数字PCR（ddPCR）技术，在60天的随访期内监测自然感染犬只的E. canis DNA血症，并将其检测效果与TaqMan实时PCR（qPCR）进行比较。共有41只血清学检测呈阳性的犬只（通过IDEXX SNAP 4Dx Plus检测确定）被纳入研究，这些犬只表现出与犬单核细胞埃立克体病（CME）一致的临床症状，作为第0天组。在第30天（n = 21只）和第60天（n = 14只）从部分重叠的队列中收集随访样本。在第0天，ddPCR在41只犬只中的33只（82.92%）中检测到了E. canis DNA，其检测效果优于qPCR（25/41；60.97%）。在第30天和第60天，ddPCR分别在21只犬中的12只（57.14%）和14只犬中的5只（35.71%）中检测到了E. canis DNA，而qPCR在第30天仅检测到2只犬中的2只（9.52%），在第60天未检测到任何阳性结果。细菌载量的定量分析显示，从第0天的中位数2.28拷贝/μL显著下降至第30天的0.067拷贝/μL（P < 0.05），并在第60天降至0.0614拷贝/μL（P < 0.05）。第0天时血红细胞比（Hct）低于25%的犬只在第30天更有可能出现ddPCR阳性结果（P = 0.035），这表明诊断时严重的贫血可能与持续的DNA血症有关。ddPCR的高灵敏度揭示了即使细菌载量很低时，E. canis DNA仍能被检测到。这种长期的细菌DNA血症需要进一步研究，结合活力检测来确定残留的DNA血症是反映了持续存在的活菌感染还是非活菌的DNA。

引言

犬埃立克体病是一种传染性疾病，属于犬媒介传播疾病（CVBDs）范畴。犬埃立克体病，也称为犬单核细胞埃立克体病（CME），是由Ehrlichia canis细菌引起的，该细菌属于阿尔法变形菌门（Alphaproteobacteria）、无形体科（Anaplasmataceae）和立克次体目（Rickettsiales）。它主要感染单核细胞或巨噬细胞。CME在临床上表现为多种症状，可分为三个主要阶段：急性期、慢性期和亚临床期。当犬只被携带该寄生虫的棕色犬蜱（Rhipicephalus sanguineus）叮咬后会发生感染。潜伏期约为8-20天。E. canis首先在单核细胞中繁殖，随后扩散到身体的各个系统，导致疾病。疾病的严重程度因阶段而异，在某些情况下可能致命。泰国所有报告均表明，与其他蜱传病原体相比，E. canis在犬只中的感染率最高且致病性最强（Eamudomkarn等人，2022年）。

传统上，犬单核细胞埃立克体病（CME）的诊断依赖于血清学检测方法，如间接免疫荧光试验或快速抗体检测试剂盒（例如SNAP 4Dx Plus）（Bélanger等人，2002年）。然而，阳性血清学结果既可能表示当前感染，也可能表示既往感染。单独使用血清学检测方法无法区分活动性感染和既往感染（Kaur等人，2020年）。分子检测方法通过直接识别血液样本中的细菌DNA，提高了E. canis的诊断准确性。这种方法对于诊断犬急性CME非常有效（McBride等人，1996年）。虽然阳性血清学结果仅表明既往感染或当前感染，但阳性PCR结果则表明存在可检测的E. canis DNA，这可能代表活动性感染或来自非活菌的残留DNA（Harrus和Waner，2011年；Harrus等人，2012年）。

滴液数字PCR（ddPCR）是一种第三代PCR技术，具有高灵敏度和准确性。绝对定量检测不需要标准曲线，后者可能引入PCR效率的变异性，因此能够提供更准确和一致的结果（Yang等人，2014年）。通过将样本分割成微滴，ddPCR提高了信噪比，能够检测到极低拷贝数的目标物质。这种方法可以在细菌或病毒载量低于qPCR检测阈值时发现慢性感染，从而改善治疗效果的监测并识别慢性感染病例（Chen等人，2021年；Ishak等人，2021年）。

ddPCR已广泛应用于人类传染病的定性和定量诊断，包括SARS-CoV-2和Mycobacterium tuberculosis（Suo等人，2020年；Ishak等人，2021年；Zhao等人，2022年）。在自然感染的犬只中，E. canis DNA的量低于实验感染病例（Baneth等人，2009年），这凸显了需要更灵敏的诊断方法。先前的ddPCR研究证明了即使在细菌载量很低的情况下也能检测到E. canis（Wichianchot等人，2022年）。这些发现强调了使用高灵敏度工具监测E. canis DNA血症的重要性。

本研究旨在使用ddPCR在关键时间点（第0天[治疗前]、第30天和治疗后的第60天）定量检测和监测自然感染犬只的E. canis DNA水平。同时，本研究还比较了这两个时间段内ddPCR与TaqMan实时PCR（qPCR）的检测效果。

动物纳入和排除标准

这项前瞻性研究是在卡塞萨特大学机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行的（批准编号：ACKU67-VET-041）。2024年5月至2024年10月期间，共有41只由主人送来的犬只因出现CME相关临床症状而被纳入卡塞萨特大学兽医教学医院（KUVTH）的研究。所有入选病例的临床症状出现时间均不超过四周，并且没有类似的既往病史

ddPCR和qPCR的检测效果

ddPCR和qPCR被用于在三个时间点检测E. canis感染情况（表2）。基线时收集了41个样本，所有犬只均接受了多西环素治疗（每日口服10毫克/公斤，持续至少四周）。其中，34只犬只（82.92%）通过ddPCR检测呈阳性。qPCR和SNAP 4Dx Plus分别检测出25只（60.97%）和41只（100%）阳性样本，所有qPCR阳性样本与ddPCR阳性结果一致。在第30天，有20只犬只未能完成随访。

讨论

本研究定量监测了感染急性期犬只血液中E. canis的动态变化。在治疗前的第0天，分子检测显示血液样本中的E. canis DNA拷贝数最高。两种分子检测方法的结果模式相似。qPCR的结果显示出初步的中等相关性（κ = 0.487，95% CI：0.23-0.74）；然而，其在后期识别E. canis的能力似乎有限。

结论

本研究证明，滴液数字PCR（ddPCR）是一种高度敏感且可靠的工具，可用于检测E. canis DNA血症，尤其是在细菌载量较低的情况下。ddPCR的表现优于TaqMan实时PCR（qPCR），后者在许多治疗后的样本中未能检测到E. canis DNA。

按照标准多西环素治疗方案治疗后，细菌载量显著下降，包括血红细胞比、血红蛋白、红细胞和血小板在内的血液学参数也明显改善。

作者贡献声明

Gunn Kaewmongkol：撰写——审稿与编辑、数据可视化、验证、监督、概念构思。 Krittanut Kanittakul：撰写——初稿撰写、资源获取、数据调查、数据管理。 Sarawan Kaewmongkol：撰写——审稿与编辑、数据可视化、验证、软件使用、方法设计、数据分析、概念构思。 Peeravit Sumpavong：撰写——初稿撰写、方法设计、数据调查。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢曼谷卡塞萨特大学兽医技术学院为这项研究提供必要的研究资源。同时，我们也感谢曼谷卡塞萨特大学兽医学院的兽医诊断实验室和兽医教学医院提供了本研究使用的样本。该项目由泰国国家研究委员会（NRCT）和卡塞萨特大学研究与发展部门资助。