尼日利亚家猪中猪细小病毒3型（PPV-3）的分子检测与系统发育分析

《EMI: Animal & Environment》：Molecular Detection and Phylogenetic Analysis of Porcine Parvovirus 3 (PPV-3) in domestic Pigs in Nigeria

本研究对尼日利亚Makurdi猪市场162份扁桃体拭子进行PPV-1至PPV-4检测，发现PPV-3阳性率7.4%，序列分析表明其与英国、韩国毒株亲缘关系密切，属同一进化分支，为非洲PPV-3分子流行病学提供新证据。

　　

摘要

猪细小病毒（PPV）会导致猪的繁殖失败，给全球养猪业造成重大经济损失。虽然已经发现了8种PPV株（PPV-1至PPV-8），但PPV-2至PPV-8在引发临床综合征中的具体作用尚不清楚。欧洲、亚洲和北美已经进行了流行病学监测，但关于撒哈拉以南非洲地区PPV的遗传多样性和进化模式的数据却很少。在尼日利亚贝努埃州马库尔迪的铁路猪市场，从162头猪的扁桃体样本中收集了样本。通过PCR分析，发现7.4%的样本中含有PPV-3。针对VP2区域的序列和系统发育分析表明，尼日利亚的PPV株遗传多样性较低，与英国和韩国的PPV株关系密切。尽管之前已有关于PPV-1和PPV-2的血清学证据，但本研究首次报告了尼日利亚存在PPV-3。因此，需要进一步研究以了解PPV在撒哈拉以南非洲的传播情况及其影响。

关键词：

• 猪细小病毒3型
• 分子检测
• 进化多样性
• 家猪
• 尼日利亚

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正文

猪细小病毒（PPV）是全球养猪业中具有经济重要性的病原体，可导致死产、胚胎死亡和不孕（SMEDI综合征）[参考文献1]。其环境适应性和高传染性加剧了经济影响。虽然目前已识别出8种PPV株（PPV-1至PPV-8），但只有PPV-1与SMEDI有明确关联，而PPV-2至PPV-8在引发临床结果中的具体作用仍不清楚[参考文献2]。细小病毒具有较高的突变率，尤其是在编码衣壳蛋白（VP）的基因中，这会导致抗原变化和毒力改变。基因重组，尤其是在VP2区域，推动了PPV的进化[参考文献3]。在撒哈拉以南非洲，喀麦隆以及多个南部、西部和东部非洲国家都检测到了PPV[参考文献4-6]。在尼日利亚，养猪业对粮食安全和经济增长至关重要，研究显示当地PPV的血清阳性率很高，并且存在与其他病毒（如非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒）的共感染[参考文献7-8]。本研究调查了尼日利亚家猪中PPV的分子流行病学情况，以了解该重要畜牧业中的流行株型和传播模式。

在本研究中，从尼日利亚贝努埃州马库尔迪铁路猪市场随机选取的162头家猪（Sus scrofa）的扁桃体样本中，通过PCR检测了PPV-1、PPV-2、PPV-3和PPV-4的存在。尽管样本来自贝努埃州，但这些猪实际上来自高原州和卡杜纳州，反映了尼日利亚不同地理区域的传播情况。记录了包括性别、年龄和品种（大白猪、长白猪、杜洛克猪）在内的人口统计数据。使用无菌拭子（Zymo Research?，美国）深入咽喉后部采集扁桃体样本，确保与扁桃体组织接触。拭子立即转移到含有2 mL DNA/RNA保护剂的试管中（Zymo Research?，美国），然后送往伊巴丹大学分子病毒学实验室进行分析。研究获得了国家兽医研究所伦理委员会的伦理批准（AEC/02/115/22）。

使用Blood-Animal-Plant DNA Preparation试剂盒（Jena Biosciences?，德国）提取病毒DNA。在25μl反应体积中，通过常规PCR扩增VP2区域，反应成分包括20 pmol正向引物、20 pmol反向引物、2 mM dNTPs、5x PCR缓冲液（Applied Biosystem）、5X Red Load Taq聚合酶（Jena Biosciences?，德国）和5 μl模板DNA。使用的特异性引物如下：PPV1F 5’-CACAGAAGCAACAGCAATTAGG-3’ 和 PPV1R 5’-CTAGCTCTTGTGAAGATGTGG-3’，PPV2F 5’-ACACGATGAGCGGTACGA-3’ 和 PPV2R 5’-TCCTCACGAGGTCTCT TCTG-3’，PPV3F 5’-GCAGTCTGCGCTTAACTT-3’ 和 PPV3R 5’-CTGCTTCATCCACTG GTC-3’，PPV4F 5’-TCATAGCACTATGGCGAGC-3’ 和 PPV4R 5’-AGCATTCTGCGTTG GACA-3’[参考文献9]。PCR条件包括：95°C预热3分钟，95°C循环35次，每次30秒；退火温度分别为51°C（PPV1）、52°C（PPV2）、50°C（PPV3）和52°C（PPV4），每次30秒；最后在72°C延伸1分钟，总共延伸5分钟。PCR使用Applied Biosystems Veriti Pro?热循环仪（美国）进行。每次PCR运行还包括一个阴性对照，使用5 μl PCR级水代替DNA模板。扩增的PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳，并用SYBR safe（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国）染色，然后用Omega Fluor Plus?透射仪（San Francisco，美国）观察。PPV-3阳性扩增子（392 bp）的强度超过15 ng，使用Qiagen? Spin Column Purification试剂盒进行纯化。核酸定量使用ThermoScientific NanoDrop One分光光度计进行。随后在尼日利亚伊巴丹大学病毒学系使用Applied Biosystems BigDye 3.1 XTerminator?试剂盒进行Sanger测序。序列在ABI 3500XL基因分析仪（Applied Biosystems，美国）上分析，并使用Sequencher 5.4.6（Gene Codes Corporation，美国）进行修剪。核苷酸序列提交至GenBank（登录号PV587499-PV587504）。

从162个随机选取的家猪扁桃体样本中，通过PCR检测了PPV-1、PPV-2、PPV-3和PPV-4的存在。尽管样本来自贝努埃州，但这些猪实际上来自高原州和卡杜纳州，反映了尼日利亚不同地理区域的传播情况。记录了包括性别、年龄和品种（大白猪、长白猪、杜洛克猪）在内的人口统计数据。使用无菌拭子（Zymo Research?，美国）深入咽喉后部采集扁桃体样本。拭子立即转移到含有2 mL DNA/RNA保护剂的试管中，并送往伊巴丹大学分子病毒学实验室进行分析。伦理批准来自国家兽医研究所伦理委员会（AEC/02/115/22）。

病毒DNA使用Blood-Animal-Plant DNA Preparation试剂盒（Jena Biosciences?，德国）提取。VP2区域在25μl反应体积中通过常规PCR扩增，反应成分包括20 pmol正向引物、20 pmol反向引物、2 mM dNTPs、5x PCR缓冲液（Applied Biosystem）、5X Red Load Taq聚合酶（Jena Biosciences?，德国）和5 μl模板DNA。使用的特异性引物如下：PPV1F 5’-CACAGAAGCAACAGCAATTAGG-3’ 和 PPV1R 5’-CTAGCTCTTGTGAAGATGTGG-3’，PPV2F 5’-ACACGATGAGCGGTACGA-3’ 和 PPV2R 5’-TCCTCACGAGGTCTCT TCTG-3’，PPV3F 5’-GCAGTCTGCGCTTAACTT-3’ 和 PPV3R 5’-CTGCTTCATCCACTG GTC-3’，PPV4F 5’-TCATAGCACTATGGCGAGC-3’ 和 PPV4R 5’-AGCATTCTGCGTTG GACA-3’[参考文献9]。PCR条件包括：95°C预热3分钟，95°C循环35次，每次30秒；退火温度分别为51°C（PPV1）、52°C（PPV2）、50°C（PPV3）和52°C（PPV4），每次30秒；最后在72°C延伸1分钟，总共延伸5分钟。PCR使用Applied Biosystems Veriti Pro?热循环仪（美国）进行。每次PCR运行还包括一个阴性对照，使用5 μl PCR级水代替DNA模板。扩增的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并用SYBR safe（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国）染色，然后用Omega Fluor Plus?透射仪（San Francisco，美国）观察。PPV-3阳性扩增子（392 bp）的强度超过15 ng，使用Qiagen? Spin Column Purification试剂盒进行纯化。核酸定量使用ThermoScientific NanoDrop One分光光度计进行。随后在尼日利亚伊巴丹大学病毒学系使用Applied Biosystems BigDye 3.1 XTerminator?试剂盒进行Sanger测序。序列在ABI 3500XL基因分析仪（Applied Biosystems，美国）上分析，并使用Sequencher 5.4.6（Gene Codes Corporation，美国）进行修剪。核苷酸序列提交至GenBank（登录号PV587499-PV587504）。

新生成的6个PPV-3序列与从GenBank检索到的代表PPV基因型1-7的30个参考序列进行了比对，另外还有46个序列与NCBI数据库中的序列具有98-100%的同源性。使用MAFFT算法在Geneious Prime 2024.0.3（Dotmatics，美国）中进行多序列比对。使用PhyML和500次自助复制构建了最大似然系统发育树。

在筛查的162个扁桃体样本中，只有7.4%（12/162）的样本检测到PPV-3（表1）。研究群体中未检测到PPV-1、PPV-2或PPV-4。PPV-3阳性样本分布在不同的猪品种中：5头大白猪、6头长白猪和1头杜洛克猪。系统发育分析显示两个不同的分支，所有6个尼日利亚PPV-3序列都聚类在分支1中，与毒力强的PPV-Kresse株在一起，而NADL-2株则单独聚类在分支2中（图1）。

图1. 使用HKY85核苷酸替换模型构建的最大似然（ML）系统发育树，显示了来自尼日利亚的6个PPV3序列（用红色方块表示）与其他全球猪细小病毒株的进化多样性

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表1. 尼日利亚家猪中猪细小病毒3型（PPV-3）的流行情况

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讨论

在12个PPV-3阳性样本中，排除了扩增效果差或色谱图质量低的样本后，获得了6个高质量的VP2基因序列。尽管本研究获得的序列与选定的参考序列具有96.4-100%的同一性，但它们之间的核苷酸同一性并非100%相同。本研究首次提供了尼日利亚家猪群体中PPV-3（也称为猪hokovirus，PHoV https://ictv.global/）存在的分子证据。这种病毒已在非洲多个地区被检测到，包括南非、刚果民主共和国和喀麦隆[参考文献2，参考文献4，参考文献10-11]。然而，我们的检测率明显低于泰国使用扁桃体组织样本报告的72.5%[参考文献12，这可能是由于采样方法（拭子与组织本身）和猪群特征的差异。

在多个猪品种（大白猪、长白猪、杜洛克猪）中检测到PPV-3，表明其传播范围广泛，与品种易感性无关。这些品种均起源于非洲以外地区，支持了猪细小病毒是从亚洲和欧洲引入的假设[参考文献6]。正如我们的研究观察到的，猪在不同地理区域的迁移可能促进了病毒的传播和维持。

对部分ORF2的系统发育分析显示，尼日利亚PPV3序列与中国、德国、韩国和英国报告的序列具有高度相似性。猪hokov病毒分支形成了一个得到强烈支持的单系群（bootstrap支持率为100%），与其他猪细小病毒（PPV）基因型明显不同。尼日利亚的分离株（用红色突出显示）在较大的猪hokov病毒分支中形成了一个亚群，与中国PPV3株（EU200671、KX827772、OR435349、MN326198）和最近从韩国描述的一个谱系（MZ856460）有共同祖先。该分支内的短分支长度表明遗传分化程度较低，表明尼日利亚株与亚洲PPV3株密切相关。这种系统发育模式表明PPV3可能是通过进口活猪或猪产品从亚洲引入尼日利亚猪群的。这与之前关于通过猪贸易传播的全球性报道一致[参考文献3，参考文献12-14]。类似地，早期研究也观察到非洲和亚洲PPV3株之间的系统发育联系，表明这些基因相关的PPV3谱系在全球范围内传播[参考文献4，参考文献11。相比之下，来自欧洲（德国和英国）的PPV3株在系统发育树上的分支较远，表明与尼日利亚分支的遗传分化较大。在尼日利亚及邻近地区持续进行基因组监测对于监测这些病毒的进化、传播途径和流行病学影响至关重要，以便更好地控制和保障生物安全。

扁桃体拭子采样对于看似健康的猪的PPV监测非常有用。作为富含淋巴组织的器官，扁桃体容易持续感染病毒，并且在常规屠宰过程中易于获取，因此适用于流行病学研究[参考文献15。这种方法在猪看似健康但实际是病毒储存库的情况下尤为重要。我们的发现支持在尼日利亚扩大扁桃体监测范围，并结合非侵入性方法（如环境采样）进行全面监测。研究的局限性包括采样点单一和潜在的选择偏差。未来的研究应包括跨多个区域的纵向采样和全基因组测序，以获得更深入的系统地理学见解。

本研究证实了尼日利亚家猪群体中PPV-3的传播，并证明了扁桃体监测在检测看似健康的动物中的猪细小病毒方面的有效性。这些发现有助于了解西非地区的PPV流行病学情况，并强调了加强尼日利亚养猪业监测和生物安全措施的必要性。未来的研究应扩大地理覆盖范围，并调查传播动态，以制定有效的疾病管理策略。

利益冲突声明

所有作者均无与本研究相关的利益冲突需要披露。

作者贡献

AA、AAM、OAB：构思了研究；AAA：获得了伦理批准并收集了样本；AYA、AF：进行了分子提取；AA、OAB进行了分子检测；AO；AF进行了测序；OAE、PFH清理了数据并进行了生物信息学处理；OAB、OAE、AI、AAM、ASA：初步起草了手稿；所有作者阅读并批准了最终稿件提交；OAB、AAA、AAM、OAE、ASA提供了初始资金；PFH、OAB监督了整个研究过程。