N端乙酰化（Nt-乙酰化）作为最常见的蛋白质修饰之一，调控着多种蛋白质功能，包括稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用和亚细胞定位[[1], [2], [3]]。Nt-乙酰化由N端乙酰转移酶（NATs）催化，这些酶利用乙酰辅酶A作为供体，将乙酰基不可逆地转移到蛋白质N端的游离α-氨基上[[4], [5], [6]]。大约80%的人类蛋白质在翻译过程中发生Nt-乙酰化[7]。Nt-乙酰化和NATs的功能障碍与多种疾病有关，包括神经退行性疾病、发育障碍和癌症[[8], [9], [10]]。例如，N端乙酰转移酶B（NatB）表达的失调通过降低未乙酰化α-突触核蛋白的稳定性促进了帕金森病（PD）的进展[11]。在亨廷顿病（HD）中，与亨廷顿蛋白相互作用的HYPK蛋白促进了N端乙酰转移酶A（NatA）依赖的N端乙酰化，而HYPK或NatA的突变通过调节这一乙酰化过程减少了Htt的聚集[12]。
为了全面阐明Nt-乙酰化的生理和病理作用，必须在蛋白质组水平上对其进行表征。基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为大规模分析Nt-乙酰化谱的强大工具。由于复杂样品中蛋白质组的动态范围广泛以及蛋白酶消化产物中Nt-乙酰化肽的丰度较低，因此在MS分析之前进行Nt-乙酰化富集是不可或缺的。此外，乙酰基会抑制Nt-乙酰化肽的离子化效率，给MS检测带来额外挑战。因此，已经开发了许多负富集策略来全局分析蛋白质N端组。在这些方法中，蛋白质水平的α-和ε-氨基都被化学阻断，随后进行蛋白酶消化以生成具有游离α-氨基的内部肽，然后通过色谱分离或固相萃取（SPE）去除。联合分级对角色谱（COFRADIC）是最经典的方法之一，首先通过反相（RP）液相色谱分离肽，然后使用三硝基苯基团对内部肽的游离α-氨基进行疏水标记。这样可以在二次RP色谱分离过程中将N端肽从疏水内部肽中分离出来[13,14]。随后开发了另一种称为基于电荷的分级对角色谱（ChaFRADIC）的方法，该方法使用两次相同的强阳离子交换（SCX）分离和电荷还原标记来富集N端肽[15,16]。然而，这些方法需要大量的分级和脱盐步骤，因此耗时且劳动强度高。另一种方法是，由于Nt-乙酰化肽通常比具有游离α-氨基的内部肽携带的正电荷少[[17], [18], [19]]，SCX色谱可以在胰蛋白酶消化后直接将Nt-乙酰化肽与内部肽分离。然而，含有组氨酸残基或切割位点被遗漏的Nt-乙酰化肽在SCX分离过程中经常被同时去除，导致部分Nt-乙酰化肽丢失。
为了解决上述问题，开发了一系列基于SPE的方法，这些方法使用各种胺反应性捕获材料来捕获和去除内部肽，包括CNBr活化的Sepharose[20,21]、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的珠子[22,23]、异氰酸酯偶联的树脂[24]、醛官能化的珠子[25,26]等[27,28]。然而，固液反应效率不足和大量使用捕获材料可能会影响Nt-乙酰化肽的回收效率。为了解决这一限制，Kleifeld等人开发了一种称为“底物末端胺同位素标记”（TAILS）的方法，通过使用水溶性树枝状聚甘油醛聚合物捕获内部肽并通过超滤去除它们[29,30]。Chen等人开发了一种疏水标记辅助的N端富集（HYTANE）方法，通过将内部肽与十六烷醛结合来增强其疏水性，然后使用C18材料高效去除[31]。然而，在上述大多数方法中，蛋白质氨基通常通过二甲胺化或乙酰化被阻断。因此，这些被阻断的赖氨酸残基很难被胰蛋白酶切割，生成较长的肽，这些肽在MS中的检测效果较差。为了解决这个问题，Sun等人提出了一种类似TAILS的方法，称为“底物末端胺胍基化”（TAGS）[32]。TAGS通过胍基化蛋白质的α-和ε-氨基来增强肽的离子化，同时保持胍基标记的赖氨酸残基的胰蛋白酶切割，从而扩大了S. cerevisiae中的N端组覆盖范围。然而，大多数现有策略主要针对全局蛋白质N端组分析设计，其中乙酰化和游离N端肽都被无选择性地富集，从而阻碍了对蛋白质N端乙酰化组的深入鉴定。
在这项工作中，我们开发了一种新型且高效的富集方法，以实现N端乙酰化的全面分析。如图1所示，首先通过基于O-甲基异脲（OMIU）的胍基化特异性阻断赖氨酸ε-氨基。胰蛋白酶消化后，生成的具有游离α-氨基的N端和内部肽被十二烷基链共价标记。十二烷基标记肽的增强疏水性使它们在C18柱上强烈保留，从而实现乙酰化N端肽的选择性富集。经过系统评估和优化，我们的方法在HeLa细胞中显著提高了乙酰化N端肽的鉴定数量。结合18O稳定同位素标记，该策略被应用于AD模型小鼠的海马组织中N端乙酰化的定量分析，提供了对Nt-乙酰化在神经退行性病理学中作用的更深入见解。
