周期蛋白依赖性激酶CDK8/19在减数分裂恢复过程中对PKA的失活是必需的

CDK8/19通过调节PKA活性影响卵子成熟，抑制其导致核膜解体和极体排出受阻，但不影响转录功能。

　　

D. 尤利娅·奥库洛娃 | A. 马克西姆·菲拉托夫 | A. 叶卡捷琳娜·瓦尔拉莫娃 | V. 安娜·特沃罗戈娃 | V. 叶夫根尼·科尔舒诺夫 | 尤利娅·西拉耶娃·尤 | V. 维克托·塔塔尔斯基 | V. 亚历山德拉·布鲁特

俄罗斯科学院基因生物学研究所，莫斯科，119334，俄罗斯

摘要

CDK8/19 是依赖细胞周期因子的转录激酶，它们并不直接控制细胞周期的进展。CDK8/19 参与胚胎发生、癌症进展、免疫激活等多个过程的调节。我们之前的研究表明，CDK8/19 对小鼠的精子发生至关重要。在这里，我们报告 CDK8/19 的活性也是卵母细胞成熟所必需的，并在卵母细胞减数分裂的重新启动中起重要作用。两种化学性质不同的 CDK8/19 抑制剂——Senexin B 和 Snx631 —— 阻止了核膜的破裂和第一极体的排出，从而阻断了从二分期退出所需的关键分子事件，包括 PKA 活性的抑制和 CDK1/细胞周期蛋白 B 复合物的激活。这种效应没有引起细胞毒性，卵母细胞在转移到新鲜培养基后可以继续其发育过程。CDK8/19 的抑制还阻止了减数分裂特有的线粒体扩张和聚集。值得注意的是，这些效应似乎与 CDK8/19 在转录中的作用无关，而转录过程并不是减数分裂重新启动所必需的。这些发现首次证明了 CDK8/19 通过独立于转录的方式调节 PKA 活性，在卵母细胞成熟中发挥作用。

引言

二分期（dictyotene）是初级卵母细胞的一个长期静止阶段，始于胚胎发生的后期阶段，此时所有卵原细胞同时进入减数分裂并停留在二分期。二分期持续到排卵，此时人类每周期有一个卵母细胞，而小鼠则有 10–20 个卵母细胞随机重新开始减数分裂。在卵巢内，卵母细胞被卵泡细胞包围，这些细胞在卵母细胞的生长和成熟过程中提供支持。透明带细胞（cumulus cells）形成最接近卵母细胞的细胞层，并通过缝隙连接（gap junctions）与卵母细胞相连。通常情况下，透明带细胞会产生 cGMP，它通过缝隙连接传递到卵母细胞内，从而抑制磷酸二酯酶 PDE3A 的活性，维持高水平的环磷酸腺苷（cyclic AMP）。环磷酸腺苷反过来激活蛋白激酶 A（PKA），而 PKA 对维持 Wee1B 激酶（也称为 Wee2）的活性是必需的。Wee1B 的主要靶标是 CDK1（也称为 CDC2），后者通过 Wee1B 依赖的磷酸化被抑制 [1]，[2]。CDK1 与细胞周期蛋白 B1 共同形成促进成熟的因子（MPF），这是减数分裂重新启动所需的主要效应因子，并磷酸化多种底物，如核纤层蛋白，导致核膜的解离。因此，来自透明带细胞的 cGMP 流入卵母细胞维持了 MPF 的失活状态，阻止了减数分裂的重新启动。

黄体生成素（LH）通过 MAPK/ERK 信号通路在透明带细胞中起作用，导致透明带细胞与卵母细胞之间的缝隙连接关闭，从而阻止 cGMP 从透明带细胞流入卵母细胞。结果，LH 通过一条漫长的分子途径诱导 CDK1 的激活和活性 MPF 复合物的形成 [1]，[2]。在 体外 模型中，通过机械去除透明带细胞也可以达到相同的效果，这会终止 cGMP 的流入。

MPF 复合物激活的另一个机制需要 PKA 从与其共存的膜周复合体（包括不活跃的 MPF、腺苷酸环化酶、Wee1B 等）转移到线粒体 [3]。此外，研究表明，在减数分裂重新启动后，线粒体活性增加，进而提高了 ATP 水平 [4]。

尽管 CDK8 和 CDK19 是依赖细胞周期因子的激酶，但它们并不直接调控细胞周期的进展。相反，它们作为可诱导基因的转录调节因子（在 [5] 中综述）以及多个信号通路（如 JAK-STAT、NOTCH 等）中的独立激酶而发挥作用（在 [6] 中综述）。然而，一些研究显示 CDK8/19 对细胞周期进展有间接影响（在 [7]，[8] 中综述）。例如，CDK8 可以抑制 E2F1 依赖的转录，而 E2F1 是 G1 期到 S 期转变的主要驱动因素 [9]。此外，一种名为 MED1 的中介蛋白在男性减数分裂过程中对细胞周期进展是必需的 [10]。我们之前的研究发现，CDK8/19 对男性配子的发生也至关重要，这表明它们可能在精子细胞的减数分裂中起直接作用 [11]。

CDK8/19 作为抗癌药物的潜在靶点受到了关注。此后，已经开发出多种化学性质不同的化合物，其中一些正在进行临床试验。我们评估了 CDK8/19 对小鼠卵母细胞减数分裂成熟的影响。在这里，我们首次报告两种化学性质不同的 CDK8/19 抑制剂 Senexin B 和 Snx631 在 体外 有效阻止了卵母细胞的成熟，防止了生殖泡的破裂，表明 CDK8/19 在卵母细胞减数分裂中起着关键作用。此外，我们的发现还表明 CDK8/19 通过调节 cAMP 水平来调控 PKA 的活性，这一点之前尚未被报道。

实验部分

实验动物

C57Bl/6J 小鼠在受控的室温条件下饲养（22–24°C 和 12.5小时光照：11.5小时黑暗的光周期）。小鼠可以自由获取食物和水。所有对动物的操作均按照当地生物伦理委员会的建议（2024年12月15日批准，生物伦理委员会结论 #21）以及《赫尔辛基宣言》（1996年）进行。

卵母细胞的收集与培养

3–4周大的 C57BL/6J 雌性小鼠通过颈椎脱位法被处死，然后处理其腹部

CDK8/19i 在 体外

中阻止卵母细胞成熟

为了研究 CDK8/19 在卵子发生中的作用，我们首先评估了 CDK8/19i 对 体外 卵母细胞成熟的影响。我们使用了两种化学性质不同的抑制剂 Senexin B 和 Snx631，这两种抑制剂具有高特异性且脱靶效应有限 [16]。根据它们各自的细胞活性报告，抑制剂的浓度分别为 3 mkM 和 1.5 mkM，以达到完全抑制活性的效果 [17]。每次我们将收集到的卵母细胞分成两个相等的组：

讨论

卵母细胞的质量及其成功的及时成熟对女性生育能力至关重要。多个分子通路参与了这一复杂过程的协调 [1]。在这里，我们首次证明中介激酶 CDK8/19 是影响哺乳动物卵母细胞成熟的调节因子之一。尽管在基因表达数据库中报告了人类卵母细胞中 CDK8 的高表达水平，但这一问题之前从未被探讨过。（https://www.bgee.org/gene/ENSG00000132964）。有趣的是

数据说明

获得的数据直接提供在手稿正文中或补充材料中。

关于写作过程中使用生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明

作者声明在准备本手稿时未使用任何 AI 或 AI 辅助技术。

CRediT 作者贡献声明

尤利娅·奥库洛娃：数据可视化、方法学、数据分析。马克西姆·菲拉托夫：写作——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、数据分析。叶卡捷琳娜·瓦尔拉莫娃：方法学。安娜·特沃罗戈娃：方法学。叶夫根尼·科尔舒诺夫：方法学。尤利娅·西拉耶娃·尤：写作——审稿与编辑、资源获取、资金申请。维克托·塔塔尔斯基：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据分析、概念构建。亚历山德拉·布鲁特：写作——审稿与

伦理批准

动物的使用符合俄罗斯联邦的法律以及当地生物伦理委员会的建议（2024年12月15日批准，生物伦理委员会结论 #21），同时也符合《赫尔辛基宣言》（1996年）的要求。

资金支持

本工作得到了俄罗斯科学基金会（RSF）的资助，项目编号为 №25–25-00151。本工作使用了俄罗斯科学院基因生物学研究所（IGB RAS）的设施，这些设施得到了俄罗斯联邦科学与高等教育部（Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响研究公正性的利益冲突。