氨基酸饥饿与铁限制协同调控肺炎克雷伯菌尿液生物膜形成的分子机制

《Biofilm》：Amino acid starvation and iron limitation facilitate the biofilm formation of Klebsiella pneumoniae within urine

本研究针对肺炎克雷伯菌在尿路感染中形成顽固生物膜的临床难题，通过Tn-seq筛选和转录组学分析，首次系统阐明了尿液环境中氨基酸饥饿（AAS）通过调控c-di-GMP信号通路促进生物膜形成的新机制。研究发现精氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸的合成缺陷会显著增强细菌在尿液中的生物膜形成能力，同时铁限制通过Fur调控网络激活EPS生物合成通路。该研究为开发针对尿路导管相关感染的抗生物膜策略提供了重要靶点。

　　

在临床感染中，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）作为重要的条件致病菌，其生物膜形成能力与导管相关尿路感染（UTIs）的顽固性密切相关。当这种革兰氏阴性菌从肠道迁移至泌尿系统后，需要适应尿液这种营养匮乏的特殊环境。然而，关于尿液中的特定环境信号如何调控肺炎克雷伯菌生物膜形成的分子机制尚不明确。

为了解决这一科学问题，南京农业大学的研究团队在《Biofilm》上发表了一项深入研究。研究人员发现，与营养丰富的LB培养基相比，肺炎克雷伯菌在尿液环境中表现出更高的生物膜形成效率。通过构建基因组饱和的转座子突变库并结合Tn-seq技术，筛选出19个在尿液生长中至关重要的适应基因，其中13个与氨基酸代谢相关，特别是精氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸的从头合成途径。

研究采用的主要技术方法包括：转座子插入测序（Tn-seq）筛选尿液适应相关基因、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测细胞内c-di-GMP水平、转录组学分析比较尿液与M9培养基中的基因表达差异、RT-qPCR验证关键基因表达、扫描电镜观察生物膜超微结构，以及使用2,2'-联吡啶创建铁限制模型。所有实验均使用健康志愿者提供的尿液样本进行。

3.1. 肺炎克雷伯菌在尿液中的生物膜形成效率增强

研究显示，在模拟体内条件的2.5%氧浓度下，肺炎克雷伯菌在尿液中的生物膜形成量（OD₅₉₅=1.725）显著高于M9培养基（OD₅₉₅=0.825）和LB培养基（OD₅₉₅=0.275）。银染和扫描电镜结果进一步证实了尿液环境中生物膜的丰富结构。

3.2. 尿液是肺炎克雷伯菌生长的氨基酸饥饿环境

Tn-seq分析揭示，尿液作为一种营养贫乏环境，其中精氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸的浓度不足以支持肺炎克雷伯菌的最佳生长，细菌必须依赖自身的氨基酸合成系统来应对这种饥饿压力。

3.3. 氨基酸饥饿促进肺炎克雷伯菌生物膜形成

实验证明，补充三种氨基酸（Ile、Met、Arg）可显著抑制野生型菌株在尿液中的生物膜形成，而单独缺失ilvGMEDA、metJBL或argBCH基因的突变株在相应氨基酸限制条件下表现出增强的生物膜形成能力，表明氨基酸饥饿是触发生物膜形成的关键信号。

3.4. 氨基酸饥饿通过调控c-di-GMP信号促进生物膜形成

转录组分析发现，与补充氨基酸的尿液相比，单纯尿液培养条件下有30个c-di-GMP相关基因表达发生显著变化，包括8个DGC（diguanylate cyclase）基因上调和4个PDE（phosphodiesterase）基因下调。LC-MS/MS检测证实氨基酸饥饿条件下细胞内c-di-GMP水平显著升高。外源性c-di-GMP处理可恢复M9培养基中的生物膜形成能力，表明c-di-GMP是连接氨基酸饥饿与生物膜形成的关键第二信使。

3.5. 肺炎克雷伯菌的EPS生物合成网络在尿液中被激活

尿液与M9培养基的转录组比较显示，与EPS生物合成相关的基因显著上调，包括脂多糖（LPS）、肽聚糖、肠杆菌共同抗原（ECA）和K荚膜合成通路。RT-qPCR验证了kdsB、lpxB、ftsW、murC、rffG、cpsG等关键基因的上调表达。

3.6. 肺炎克雷伯菌通过增加EPS生物合成响应尿液铁限制以形成生物膜

研究发现，铁离子浓度对生物膜形成具有双重调控作用：10μM Fe3?可促进生物膜形成，而250μM Fe3?则显著抑制。fur基因缺失突变株在高铁条件下仍保持较强的生物膜形成能力，表明Fur（ferric uptake regulator）介导了铁限制对EPS生物合成的调控。铁螯剂实验进一步证实，铁限制通过解除Fur对EPS合成基因的抑制来促进生物膜形成。

研究结论表明，肺炎克雷伯菌通过感知尿液中的氨基酸饥饿和铁限制信号，分别激活c-di-GMP信号通路和Fur调控网络，协同促进EPS生物合成和生物膜形成。这种多层次的适应性调控机制解释了肺炎克雷伯菌在泌尿系统中的强持久性，为开发针对尿路感染的新型抗生物膜治疗策略提供了理论依据。值得注意的是，不同肺炎克雷伯菌菌株间存在遗传多样性，这些调控机制的普适性仍需在更广泛的临床分离株中进行验证。未来研究可进一步探索流动尿液条件下和多菌种生物膜群落中的种间相互作用，以更全面地模拟自然感染情境。