《Biological Control》：Exploring the biocontrol potential of
Streptomyces sp. B2008 through mechanistic insights into the antifungal effect of actinomycin D
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本研究针对香蕉枯萎病毁灭性病原真菌Foc TR4，从红树林来源的链霉菌Streptomyces sp. B2008中分离获得放线菌素D，通过转录组学、分子对接和基因敲除技术，揭示其通过下调关键膜蛋白基因FOIG_02707和FOIG_05942的表达，破坏菌丝生长、孢子形成和致病性的新机制，为开发新型生物防治剂提供了理论依据。
香蕉，这种全球产量、贸易量和消费量均位居前列的水果，正面临着一种毁灭性疾病的威胁——香蕉枯萎病。该病由土壤中的尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc）引起，尤其以热带4号小种（Tropical Race 4, Foc TR4）危害最为严重，它能侵染几乎所有的卡文迪什香蕉品种。Foc TR4通过根系侵入香蕉维管系统，阻碍水分和养分运输，导致植株枯萎死亡。更棘手的是，其产生的厚垣孢子能在土壤中存活多年，极难根除。目前，培育抗病品种、化学防治和生物防治是主要的防控策略，但效果有限且可能带来环境问题。因此，寻找高效、环保的生物防治资源迫在眉睫。
链霉菌（Streptomyces）作为重要的微生物资源库，能够产生丰富多样的抗菌活性物质，在农业生物防治中展现出巨大潜力。然而，尽管已有许多研究报道链霉菌粗提物对Foc TR4有抑制效果，但其具体的作用机制，特别是其中关键活性物质如何抑制病原菌的分子机理，尚不清晰。此前，研究人员从北部湾红树林沉积物中分离到一株链霉菌Streptomyces sp. B2008，该菌株对包括Foc TR4在内的多种植物病原菌表现出强烈的拮抗活性，并被鉴定为Streptomyces parvulus。为了深入探究其生防机制，研究人员对其发酵产物进行了研究，并成功分离到一种已知的抗肿瘤抗生素——放线菌素D（actinomycin D）。虽然放线菌素D的抗菌和抗肿瘤活性早有报道，但其对Foc TR4的具体抑制机制仍有待阐明。本研究旨在揭示放线菌素D抑制Foc TR4的分子机制，并评估链霉菌B2008作为生防制剂的应用前景。相关研究成果发表在《Biological Control》上。
为开展本研究，研究人员运用了几项关键技术：通过盆栽实验评估了链霉菌B2008发酵液对香蕉植株生长的影响及其对Foc TR4的防治效果；采用琼脂稀释法测定了纯化的放线菌素D对Foc TR4菌丝生长的半最大效应浓度（EC50）；利用转录组测序（RNA-seq）技术分析了经放线菌素D处理后的Foc TR4基因表达谱变化；通过分子对接（Molecular Docking）预测了放线菌素D与差异表达蛋白的相互作用；运用基因敲除（Gene Knockout）技术构建了Foc TR4的关键基因缺失突变体（ΔFOIG_02707, ΔFOIG_05942, ΔFOIG_09283），并系统评价了这些突变体在菌丝形态、产孢能力、对环境胁迫（氧化胁迫、渗透胁迫、细胞壁胁迫）的敏感性、细胞内活性氧（ROS）水平以及致病性方面的变化。用于实验的香蕉幼苗（Williams B6品种）和Foc TR4菌株由广西壮族自治区农业科学院提供。
3.1. 菌株B2008对Foc TR4的生防效果
盆栽实验表明，施用链霉菌B2008的发酵液虽未显著降低香蕉枯萎病的发病率，但能明显促进香蕉植株的生长，特别是在与Foc TR4共同处理的组别中，香蕉的根茎长度和假茎粗度均有显著增加。这表明B2008具有促进植物生长的潜力，但其在盆栽条件下的直接生防效果可能受发酵液中活性物质含量等因素影响而较弱。
3.2. 放线菌素D对Foc TR4的抑制活性
体外抑菌实验显示，放线菌素D能有效抑制Foc TR4菌丝生长，其EC50值为26 μg mL?1。扫描电子显微镜（SEM）观察发现，经放线菌素D处理的Foc TR4菌丝出现萎缩、扭曲和畸形，表明其细胞结构遭到破坏。
3.3. 参与放线菌素D抗真菌活性的基因
转录组分析显示，放线菌素D处理导致Foc TR4中大量基因表达差异，共有6284个差异表达基因，其中3491个下调。基因本体（GO）富集分析表明，下调基因显著富集于跨膜运输、膜组成等过程。结合分子对接分析，研究人员筛选出三个与放线菌素D具有高结合自由能且表达显著下调的膜相关基因：FOIG_02707（推测为艾索体蛋白Eisosome）、FOIG_05942（过敏原同源蛋白）和FOIG_09283（功能未知蛋白）。qRT-PCR验证了放线菌素D处理后这三个基因的表达均显著降低。
3.4. FOIG_02707和FOIG_05942参与营养生长
通过基因敲除技术获得了三个基因的缺失突变体。表型分析发现，ΔFOIG_09283突变体菌丝生长未受显著影响，但气生菌丝减少；而ΔFOIG_02707和ΔFOIG_05942突变体的菌丝生长均受到明显抑制。SEM观察进一步揭示，ΔFOIG_02707和ΔFOIG_05942突变体的菌丝出现严重畸形、破裂和肿胀，尤其是ΔFOIG_02707突变体表型更为严重，表明这两个基因对Foc TR4菌丝的正常生长至关重要。
3.5. FOIG_02707和FOIG_05942参与分生孢子形成
产孢能力检测显示，ΔFOIG_09283突变体的产孢量与野生型无显著差异，而ΔFOIG_02707和ΔFOIG_05942突变体完全丧失了产孢能力，说明FOIG_02707和FOIG_05942是Foc TR4分生孢子形成所必需的。
3.6. FOIG_02707和FOIG_05942参与胁迫响应
胁迫敏感性实验表明，ΔFOIG_02707和ΔFOIG_05942突变体对氧化胁迫（H2O2）、细胞壁胁迫（刚果红）、渗透胁迫（NaCl）以及不同碳源利用的耐受性均显著下降。同时，这两个突变体内的活性氧（ROS）水平急剧升高，ΔFOIG_05942突变体的ROS水平升高尤为显著，表明基因缺失导致细胞氧化应激加剧和细胞完整性受损。
3.7. FOIG_02707和FOIG_05942突变体影响Foc TR4的致病性
致病性测定发现，接种野生型Foc TR4的香蕉幼苗表现出典型的枯萎病症，病害指数达80%。ΔFOIG_09283突变体致病性略有减弱（病害指数72%），而ΔFOIG_02707和ΔFOIG_05942突变体几乎丧失致病性，仅引起轻微症状（病害指数分别为32%和28%），香蕉根茎保持健康状态。这表明FOIG_02707和FOIG_05942是Foc TR4致病性的关键因子。
本研究得出结论，源自红树林的链霉菌Streptomyces sp. B2008及其产生的抗生素放线菌素D在防治香蕉枯萎病病原菌Foc TR4方面具有重要潜力。其作用机制在于，放线菌素D能够靶向并影响Foc TR4中两个关键基因FOIG_02707和FOIG_05942的表达。这两个基因的缺失会直接导致病原菌菌丝生长缺陷、孢子产生完全抑制、细胞壁完整性破坏、对环境胁迫的耐受性下降以及细胞内活性氧失衡，最终显著削弱其致病能力。该研究不仅从分子水平揭示了放线菌素D抑制Foc TR4的新机制，鉴定出两个新的潜在药物作用靶点（FOIG_02707和FOIG_05942），也为进一步开发以Streptomyces sp. B2008或放线菌素D为基础的高效、环保型生物农药提供了坚实的理论依据和新的策略。然而，FOIG_02707（艾索体蛋白）和FOIG_05942（过敏原同源蛋白）在Foc TR4中调控细胞完整性、胁迫响应和致病性的具体分子通路，仍有待未来研究深入解析。
