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DNA纳米佐剂AdjCRU通过四向交叉结构增强TLR9结合与细胞摄取，显著提升肺鼠疫疫苗的免疫应答及小鼠存活率（提高40%）。
傅胜南|李志新|尹哲|张曦|宋晓琳|胡凌飞|周东升|苏欣|戴晨曦
中国人民解放军军事医学科学院病原生物学与生物安全国家重点实验室，北京100071
摘要
由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）引起的肺鼠疫由于其高死亡率和快速进展性，仍然是一种致命的威胁。在我们之前的研究中，用CpG寡脱氧核苷酸配制的鼠疫耶尔森菌抗原显示出对抗肺鼠疫的巨大潜力，但这些激动剂对TLR9的亲和力较低，稳定性差，细胞摄取有限，并且诱导组织驻留记忆免疫的能力较弱。在这里，我们介绍了一种名为AdjCRU的十字形DNA纳米佐剂，它基于一个四路连接结构，每个分支都含有环状CpG基序（LoDNA），用于与TLR9结合。通过计算设计和分子动力学模拟，选择这种四路连接结构而非其他纳米结构，因为其具有更强的TLR9结合能力。AdjCRU具有抗核酸酶性，通过一步退火四种单链寡核苷酸制备而成。当通过气溶胶方式经气管内接种与鼠疫耶尔森菌重组抗原rV10一起使用时，AdjCRU能够有效地被抗原呈递细胞（APC）内化，从而显著增强APC的成熟、生发中心反应、系统性和黏膜抗体滴度以及T/B细胞的激活。值得注意的是，在致命的肺鼠疫小鼠模型中，rV10+AdjCRU组合能显著提高40%的存活率。通过将可编程性、生物相容性和增强的TLR9刺激整合到一个模块化平台上，AdjCRU为下一代针对呼吸道病原体的黏膜佐剂提供了一种多功能策略。
引言
鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）是一种革兰氏阴性细菌，是鼠疫的致病菌，这种严重的动物源性疾病在美洲、非洲和欧亚大陆都有流行焦点[1]。主要的传播途径包括气溶胶吸入、摄入受污染的物质、经皮肤接触以及被感染的野生跳蚤叮咬。根据感染途径的不同，鼠疫表现为三种主要临床形式：肺鼠疫、腺鼠疫和败血症鼠疫。其中，肺鼠疫是最具侵袭性的形式，潜伏期仅为24-96小时。早期症状通常包括发热、头痛和不适，随后迅速发展为肺炎，表现为呼吸困难、胸痛、咳嗽和咳出带血或水样的痰液。肺鼠疫的严重性在于如果不进行治疗，其死亡率非常高。至关重要的是，治疗窗口极其狭窄，通常需要在症状出现后的24小时内进行有效治疗[2]。超过这个关键时期，死亡率会超过50%，这凸显了迫切需要有效的预防和快速响应策略来对抗这种高度侵袭性的疾病。
疫苗仍然是预防鼠疫的一种非常有前景的方法。我们之前的研究表明，亚单位疫苗——无论是以粉末还是液体形式，并添加了Toll样受体9（TLR9）激动剂胞苷-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）作为佐剂——通过气溶胶方式经气管内接种后，能够引发强烈的保护性免疫反应[3]。CpG ODNs被认为是一种有效的黏膜佐剂，可以显著增强疫苗诱导的免疫反应的强度、广度和持久性[4]。然而，游离的CpG ODNs容易受到核酸酶的降解。此外，有效的免疫刺激需要将CpG ODNs递送到溶酶体隔室，在那里它们与TLR9二聚体结合并激活下游信号通路，因此需要有效的细胞摄取[5]。尽管CpG ODNs具有潜力，但它们在激活肺驻留记忆免疫细胞（特别是组织驻留记忆T细胞（Trm）和B细胞（Brm）方面的作用仍不完全清楚。这些细胞群体对于维持局部免疫至关重要，并在保护免受呼吸道病原体侵害方面起着重要作用[6],[7]，尤其是在肺鼠疫中[8]。因此，大量的研究工作致力于提高CpG ODNs的体内稳定性、安全性和靶向递送效率，以最大化其免疫学潜力，同时尽量减少脱靶效应。
纳米粒子介导的递送是一种新的CpG ODNs递送方法，具有多种优势，如控制CpG ODNs的药代动力学、保护其免受降解、靶向其积累以及增强细胞摄取以改善免疫反应[9]。在所有纳米粒子递送系统中，CpG功能化的纳米粒子通常显示出更好的递送效率，大多数报道的系统基于非DNA载体材料，包括无机纳米粒子（例如金或二氧化硅纳米粒子）、聚合物纳米粒子（例如PLGA或阳离子聚合物）和基于脂质的纳米粒子，但这些材料往往引入了关于长期生物相容性、生物降解性和安全性评估的额外问题，从而增加了转化的复杂性[9]。相比之下，DNA纳米载体由于其内在的安全性、优异的生物相容性、自组装能力和高可编程性，成为CpG ODNs递送的一个特别有吸引力的平台[10],[11]。此外，DNA纳米载体无需任何转染剂的帮助即可直接进入细胞[12],[13]。Distler及其同事使用DNA树状体作为疫苗设计平台，首先研究了决定分子疫苗效力的结构-功能关系，然后发现了一种能够在小鼠宫颈癌模型中显著减少肿瘤负担并保持100%动物存活率的架构[14]。Qu等人通过单宁酸和DNA的超分子组装成功合成了基于DNA的纳米粒子，这些粒子促进了CpG和抗原卵白质的共同递送，从而通过肌肉注射在小鼠体内有效诱导了抗原特异性的体液和细胞免疫[15]。DNA折纸系统是另一种常见的递送策略，通过在大型DNA支架上密集排列CpG基序来增强TLR9的激活，但它们依赖于长的单链模板和多个短寡核苷酸的复杂组装，这提高了合成成本并限制了可扩展性和批次间的一致性[16]。然而，这些装载了CpG ODNs的DNA纳米结构主要应用于治疗研究[15],[17]，特别是在肿瘤治疗中。关于它们作为黏膜佐剂或抗菌疫苗开发的应用研究较少。
在本研究中，我们设计了三种分支DNA纳米结构：三路连接（3WJ）、四路连接（4WJ）和五路连接（5WJ），每个分支都结合了一个环状DNA（LoDNA），该LoDNA基于双茎环免疫调节剂MGN1703进行了修饰[18],[19],[20],[21]，并含有三个CpG基序（图1A）。通过分子对接和分子动力学模拟，4WJ-TLR9复合物显示出最大的结合稳定性，因此我们将这种DNA纳米佐剂命名为AdjCRU。然后通过一步退火四种单链寡核苷酸（S1-S4）制备了AdjCRU，每种寡核苷酸通过沃森-克里克碱基配对与LoDNA结合（图1B）。这种设计将LoDNA战略性地定位在纳米结构的外部，以实现最佳的TLR9识别并提高LoDNA的稳定性。当与鼠疫耶尔森菌重组抗原rV10混合并通过气溶胶方式经气管内接种到肺部时，AdjCRU被有效地被抗原呈递细胞（APC）内化，并运输到含有TLR9的溶酶体中。十字形的AdjCRU通过两个分支稳定地与TLR9结合，从而触发TLR9/NF-κB信号级联反应，诱导IL-6和TNF-α的分泌。这种佐剂设计显著提高了LoDNA的摄取效率、APC的激活和抗原处理。因此，AdjCRU显著增强了系统性免疫，表现为生发中心（GC）反应、强烈的B细胞反应、增强的CD4+辅助T细胞（Th）和CD8+细胞毒性T细胞（Tc）反应，以及免疫球蛋白G（IgG）和分泌型IgA（sIgA）的产生。最重要的是，AdjCRU增强了肺驻留记忆免疫，包括驻留的B细胞和T细胞反应，这对于快速和局部的免疫保护至关重要[8]。在致命的肺鼠疫小鼠模型中，rV10+AdjCRU的三剂免疫接种比rV10+LoDNA组合提高了40%的存活率。鉴于这些优势，AdjCRU代表了一种有前景的黏膜佐剂，可用于应对多种传染病和恶性肿瘤。
纳米佐剂AdjCRU的合理设计与表征
鉴于游离的CpG ODNs具有较差的细胞摄取性并且容易受到核酸酶的快速降解，因此需要一个优化的递送载体来精确地靶向溶酶体中的TLR9。十字形DNA纳米结构（4WJ）最早于1983年被描述为一种人工组装的DNA架构[22]，随后开发了3WJ、5WJ和更高阶的纳米结构以增强免疫刺激活性[23],[24],[25]，这些结构以其简洁性而著称
结论
在这项研究中，我们开发并严格表征了一种可吸入的十字形DNA纳米佐剂AdjCRU，作为一种模块化的TLR9激动剂，能够显著增强针对肺鼠疫的系统性和肺驻留记忆免疫。AdjCRU的设计包括4个关键特性：i) 通过计算机优化设计的4WJ支架，以实现高亲和力的双臂TLR9结合和卓越的结合稳定性；ii) S1-S4的可编程一步组装，每个寡核苷酸都通过沃森-克里克碱基配对与LoDNA精确结合
CRediT作者贡献声明
张曦：方法学、研究、数据分析。尹哲：监督、资源提供。胡凌飞：验证、监督。宋晓琳：研究、数据分析。李志新：方法学、研究、数据分析、数据管理。傅胜南：撰写——初稿、可视化、方法学、研究、数据分析。苏欣：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化。周东升：可视化、验证、监督、资源提供，
数据可用性声明
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利益冲突声明
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