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钛合金与羟基磷灰石复合材料的骨整合机制研究：硼化Ti6Al4V/HA复合材料通过表面微纳米结构调控基因表达（TRIP13、CYP1A1等），激活PI3K/Akt信号通路促进成骨分化。
陈一宏|陈晓洁|刘博宇|熊恒荣|彭志伟|彭倩
中南大学湘雅医学院湘雅口腔医院，中国湖南长沙410008
摘要
由于钛及其合金具有优异的生物相容性和耐腐蚀性，因此被广泛用于牙科植入物。然而，它们的弹性模量与骨骼不匹配，且界面生物活性不足，这通常限制了其骨整合性能，尤其是在植入后的早期阶段。为了解决这些限制，开发了一种经过硼化的Ti6Al4V/羟基磷灰石（HA）复合材料，该复合材料在结构和生物性能上都有所改进。扫描电子显微镜和原子力显微镜观察发现，这种材料表面具有微纳结构，并且粗糙度增加。在复合材料上培养的成骨细胞的RNA测序结果显示，与Ti6Al4V相比，有683个基因表达上调，838个基因表达下调。基因本体论分析揭示了与细胞粘附、细胞外基质重塑和整合素介导的信号传导相关的生物过程；KEGG通路分析表明细胞周期、PI3K/Akt和钙信号通路被激活。基因集变异分析进一步突出了8个关键上调基因：CYP1A1、CRLF2、HBEGF、IRAK2、DLL1、CYP1B1、BLOC1S5-TXNDC5和TRIP13。功能验证表明，TRIP13的表达与成骨分化呈正相关，并且与PI3K/Akt信号通路的激活有关。总体而言，这些发现证明了硼化Ti6Al4V/HA复合材料表面的TRIP13相关转录反应与成骨调控有关，为设计具有更好骨整合性能的生物活性钛基植入物提供了机制上的见解。
引言
由于植入支持修复在美学、舒适性和保护邻近牙齿方面的优势，已成为无牙区域修复的首选方法[1]。目前，金属/陶瓷复合材料（如Ti6Al4V/羟基磷灰石（HA）复合材料）受到了越来越多的关注，因为它们结合了金属的优异机械性能和陶瓷的优异生物活性，从而提高了与周围组织的相容性[2]。与基于涂层的改性技术相比，后者容易出现粘结强度不足和降解或分层的风险，而基于粉末的成型方法（例如烧结和3D打印）可以直接将金属粉末与生物活性掺杂剂或化合物结合，从而更广泛地控制植入物的机械和生物性能[3]。在这些技术中，微波烧结在口腔植入物制造中得到了广泛应用，因为它具有加热速度快、烧结温度低、微观结构细化、性能提升和无污染处理等优点。通过采用微波辅助烧结，可以高效制造出具有理想机械和生物特性的钛合金/HA复合材料[4]。然而，由于金属相和陶瓷相在物理和化学性质上的显著差异，通常需要添加添加剂来增强复合材料内部的界面粘结并提高其整体性能。
在我们之前的工作中，我们通过混合Ti6Al4V、纳米HA和TiB?粉末并采用微波烧结方法，成功制备了用于牙科植入的硼化Ti6Al4V/HA复合材料。体外细胞实验和体内动物实验均证实了该材料的优异生物活性和骨整合潜力，有利于临床应用[5]、[6]。然而，关于具有微纳结构表面和生物活性的硼化Ti6Al4V/HA复合材料上成骨分化和骨整合的详细机制仍有待进一步阐明。
作为钛基复合材料中的一种代表性生物活性元素，硼（B）因其在维持关节健康、增强骨密度和加速人体骨折愈合方面的作用而受到越来越多的关注[7]。先前的研究表明，掺硼的生物材料能够促进成骨分化并加速骨再生[8]。羟基磷灰石是一种众所周知的生物活性陶瓷，其化学成分与人体骨骼和牙齿的无机成分相似，能够在植入后快速形成新的骨骼和牙本质[9]。然而，目前关于含硼和HA的生物材料的研究主要集中在表型观察上，对相关基因表达变化和细胞反应的了解有限。这一差距阻碍了人们对材料表面形态和化学成分如何影响骨整合生物过程的全面理解。
为了解决上述问题，我们采用RNA测序（RNA-seq）技术，获得了在硼化Ti6Al4V/HA复合材料表面培养的成骨细胞的全基因组转录组谱型，旨在识别关键的成骨相关基因，并探索与该复合材料表面响应相关的分子机制。本研究有望为合理设计硼化钛合金基复合材料提供理论基础，从而更好地理解材料性能如何调节成骨反应并提高骨整合性能。
材料制备与表征
材料的制备与表征
首先，按90% Ti6Al4V、5% HA和5% TiB?的质量比混合Ti6Al4V、HA和TiB?粉末。将混合粉末在真空球磨机中研磨12小时，然后在900 MPa的压力下进行单轴压实。所得到的绿色压坯在高纯度氩气氛围中于1050°C下微波烧结30分钟，从而获得硼化Ti6Al4V/HA复合材料。使用的商业Ti6Al4V圆盘（直径8毫米×2毫米；Guanyue金属材料有限公司）和制备的硼化Ti6Al4V/HA复合材料
材料的表面微观结构和形态
图2A-D展示了通过SEM观察到的Ti6Al4V和硼化Ti6Al4V/HA复合材料的表面微观结构。图2A和图2B分别以低倍率和高倍率显示了Ti6Al4V组的表面形态，表面相对光滑，没有明显的相分布。相比之下，图2C和图2D展示了硼化Ti6Al4V/HA复合材料的表面，呈现出典型的多相复合结构。图2C展示了硼化表面的整体情况
结论
为了阐明硼化Ti6Al4V/HA复合材料的成骨诱导和骨整合性能的分子机制，进行了RNA-seq分析及后续验证实验。结果表明，在该复合材料表面培养的成骨细胞中，CYP1A1、CRLF2、HBEGF、IRAK2、DLL1、CYP1B1、BLOC1S5-TXNDC5和TRIP13的表达显著上调。功能分析进一步表明，TRIP13表达的调节与成骨细胞的变化有关
CRediT作者贡献声明
陈一宏：撰写——原始草案、方法学、正式分析、数据管理、概念构思。陈晓洁：可视化、方法学、概念构思。刘博宇：资源获取、数据管理。熊恒荣：资源获取、数据管理。彭志伟：数据管理。彭倩：撰写——审稿与编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究部分得到了国家自然科学基金（项目编号：82201113）、湖南省自然科学基金（项目编号：2023JJ20088）以及湖南省科技创新计划（项目编号：2023RC3089）的资助。
