《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Gene expression profiles associated with carboplatin chemoresistance in high-grade serous ovarian cancer: insights from 2D and 3D models
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本研究针对高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)卡铂化疗耐药这一临床难题，结合TCGA患者转录组数据与先进3D体外模型，系统揭示了基质重塑基因MMP9的上调以及EMT-ECM基因共表达网络的重构是铂类耐药的关键特征。研究发现3D模型能更好地模拟临床耐药表型，并鉴定出MMP9、TWIST2、ZEB2和WNT11作为克服HGSOC化疗耐药的有前景生物标志物，为开发靶向治疗策略提供了新见解。
卵巢癌是全球女性癌症相关死亡的第三大原因，其中高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是最常见且最具侵袭性的亚型。尽管患者最初对以铂类药物（如卡铂）为基础的化疗敏感，但超过70%的患者会在两年内复发，并最终产生耐药性，导致晚期患者五年生存率仅为20-40%。这种化疗耐药性的产生机制复杂，成为提高HGSOC治疗效果的主要障碍。
为了深入理解卡铂耐药的分子机制，研究人员开展了一项整合生物信息学与功能性实验的研究。他们从患者肿瘤组织的基因表达数据入手，结合能更好模拟体内肿瘤微环境的三维(3D)细胞培养模型，旨在揭示驱动耐药的关键基因和信号通路。
研究人员首先利用癌症基因组图谱(TCGA)中HGSOC患者的数据，比较了铂类敏感与耐药肿瘤的基因表达差异。分析发现，在铂类耐药肿瘤中，基质重塑基因MMP9显著上调。为了在更接近临床的环境中验证这些发现，研究团队构建了四种HGSOC细胞系（COV362、Kuramochi、OVCAR-4和OVSAHO）的3D球体模型，并与传统的二维(2D)培养模型进行对比。
研究证实，3D模型对卡铂的半数抑制浓度(IC50)显著高于2D模型，表现出更强的耐药性，这与临床观察到的化疗耐药现象更为一致。这种差异主要归因于药物在致密的3D球体结构内渗透性降低，限制了化疗药物对球体内部细胞的暴露。功能分析显示，在IC50浓度下，卡铂诱导了G0/G1期细胞周期阻滞并降低了Ki67水平，表明其产生了细胞静止效应而非强烈的细胞毒性作用。
关键的发现来自于基因表达分析。qPCR（实时荧光定量PCR）证实，在3D模型中，MMP9、TWIST2、ZEB2和WNT11基因的表达在卡铂处理后出现显著上调，且这种上调具有几何结构（2D vs 3D）和治疗依赖性。这些基因的上调模式重现了在患者耐药肿瘤中观察到的适应性耐药特征。进一步的相关性分析和生存分析显示，MMP9的高表达与较好的总生存期(OS)相关，而TWIST2、ZEB2和WNT11的高表达则与较短的无进展生存期(PFS)显著相关，凸显了它们作为预后生物标志物的潜力。蛋白质相互作用网络（STRING分析）和基因本体论(GO)富集分析也支持了ZEB2和TWIST2在调控上皮间质转化(EMT)和细胞可塑性中的核心节点作用。
本研究成功地将临床数据与先进的体外模型相结合，不仅验证了已知的耐药相关通路，还识别出MMP9、TWIST2、ZEB2和WNT11这一基因组合作为HGSOC铂类耐药的关键调控因子。这些发现强调了肿瘤微环境，特别是三维结构在驱动化疗耐药中的重要性，为未来开发逆转耐药的新型治疗策略提供了重要的靶点和理论依据。该研究发表于《Biomedicine》期刊。
为开展本研究，作者主要应用了以下几项关键技术：1） 利用公共数据库（如TCGA、cBioPortal）进行HGSOC患者转录组数据挖掘和生存分析（Kaplan-Meier Plotter）；2） 建立四种HGSOC细胞系的二维(2D)单层培养和三维(3D)球体模型，以模拟体内肿瘤微环境；3） 使用qPCR技术检测与DNA修复、EMT、基质重塑、缺氧、血管生成、Wnt信号通路等相关的22个基因的表达水平；4） 采用流式细胞术分析卡铂处理前后3D球体的细胞周期分布和Ki67增殖标志物表达；5） 应用ToxiLight生物测定法和细胞计数法评估卡铂在不同模型中的细胞毒性（IC50测定）和细胞活力。
3.1. MMP2基因参与基质重塑，在耐药和敏感HGSOC组织中的表达存在差异
对TCGA数据集的分析揭示，基质重塑基因MMP9在铂类耐药HGSOC组织中显著上调。在分析的22个基因中，唯有MMP2在铂类耐药与敏感肿瘤间的表达差异具有统计学意义，将其确立为潜在的耐药生物标志物。
3.2. 铂类耐药破坏了EMT–ECM基因相关性网络
Spearman相关性分析显示，在铂类敏感组织中，MMP2与多个EMT相关转录因子（如SNAI1、SNAI2、ZEB2、TWIST2）存在强烈的正协同表达。而在铂类耐药组织中，虽然许多EMT基因之间仍保持强相关性，但以MMP2为中心的共表达网络发生了显著改变，其与EMT基因（如SNAI1、SNAI2、ZEB1、TWIST1、VIM）的相关性进一步增强或出现新的显著关联，表明在药物压力下发生了EMT-ECM信号网络的功能性放大或重连，这可能对促进生存和产生耐药性起关键作用。
3.3. MMP9, MMP2, WNT11, TWIST2, ZEB1和ZEB2作为HGSOC的潜在预后生物标志物
生存分析表明，高表达ZEB1和WNT11与较短的总生存期(OS)相关，而高表达MMP9则与较长的OS相关。在无进展生存期(PFS)分析中，高表达TWIST2、ZEB1、ZEB2、MMP2和WNT11与较短的PFS相关，其中ZEB2与早期复发强烈相关。这些基因的共表达模式进一步支持其作为复发和耐药生物标志物的潜力。
3.4. HGSOC细胞系在3D模型中显示出不同的卡铂敏感性谱
卡铂在四种HGSOC细胞系3D模型中的IC50值测定显示，其耐药性普遍高于2D模型，且细胞系间的敏感性排序在2D和3D模型中存在差异（如OVSAHO在2D中敏感，在3D中变为相对耐药），突出了3D模型在模拟临床耐药方面的优势。这种差异可能与3D球体的结构密度、细胞外基质(ECM)沉积以及药物扩散梯度有关。
3.5. 卡铂在3D球体中引起细胞周期阻滞和增殖减少
流式细胞术分析表明，在IC50浓度下，卡铂在3D球体（如COV362、OVCAR-4）中主要诱导G0/G1期细胞周期阻滞和Ki67阳性细胞比例下降，表现出细胞静止效应，而非显著的细胞毒性（未观察到明显的sub-G1峰）。这种反应在不同细胞系间存在差异，更准确地模拟了体内肿瘤在化疗压力下的适应性生存反应。
3.6. 3D模型的qPCR验证强烈模拟了铂类耐药转录谱
qPCR验证显示，卡铂处理在3D模型中特异性地上调了TWIST2、ZEB2、WNT11等基因，这种上调在2D模型中不明显或模式不同。3D环境更能激发与侵袭、基质重塑和生存相关的转录程序，再现了在铂类耐药患者肿瘤中观察到的适应性EMT和信号反应。
本研究通过整合患者数据与生理相关性更高的3D模型，系统阐明了HGSOC对卡铂的耐药机制。研究结果表明，化疗耐药不仅与单个基因的异常表达有关，更与EMT-ECM基因网络的整体重构和协同调控密切相关。3D模型由于其能更好地模拟肿瘤的异质性、细胞间相互作用以及药物渗透屏障，在预测化疗反应和揭示耐药机制方面优于传统2D模型。所鉴定的MMP9、TWIST2、ZEB2和WNT11等关键基因，不仅作为有前景的预后生物标志物，也为未来开发针对肿瘤微环境和细胞可塑性的联合治疗策略提供了新的靶点。这项工作强调了在临床前研究中采用先进模型系统的重要性，以弥合实验室发现与临床疗效之间的差距，最终推动HGSOC的精准医疗发展。
