《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Engineering a fifth-generation CAR T cells to overcome PD-L1-mediated immunosuppression in lung cancer
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本研究针对肺癌免疫抑制微环境（TME）中PD-L1上调导致CAR-T细胞疗法疗效受限的难题，开发了新型第五代抗叶酸受体α（FRα）CAR-T细胞（抗FRα-CAR5），该细胞能同时靶向FRα并分泌PD-L1阻断性单链可变片段（scFv）。体外实验证实，抗FRα-CAR5 T细胞对表达不同水平FRα和PD-L1的肺癌细胞系均展现出显著增强的特异性细胞毒性和增殖能力，尤其在长期抗原再攻击实验中维持了更强的抗肿瘤活性。该研究为克服肺癌PD-L1介导的免疫抑制提供了有前景的联合治疗策略。
肺癌，尤其是非小细胞肺癌（NSCLC），是全球范围内癌症相关死亡的主要原因之一，其治疗面临巨大挑战。尽管免疫疗法，如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法，在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但在实体瘤中的应用却步履维艰。这主要归因于实体瘤复杂的肿瘤微环境（TME），其中充满了各种免疫抑制因素。在肺癌中，程序性死亡配体1（PD-L1）的过度表达是一个关键的免疫逃逸机制。当肿瘤细胞表面的PD-L1与T细胞上的程序性死亡受体1（PD-1）结合时，会向T细胞传递“刹车”信号，抑制其活化和杀伤功能，从而导致CAR-T细胞在面对实体瘤时“有心无力”。因此，如何破解PD-L1介导的免疫抑制，成为提升CAR-T细胞治疗实体瘤效果的核心问题之一。
叶酸受体α（FRα）是一种在多种上皮性癌症（如卵巢癌、乳腺癌和肺癌）中过度表达的细胞表面蛋白，而在正常组织中表达有限，这使其成为一个颇具吸引力的治疗靶点。在非小细胞肺癌中，特别是在肺腺癌中，FRα的表达也相当普遍。然而，单独靶向FRα的CAR-T细胞疗法，仍可能被肿瘤微环境中高水平的PD-L1所抑制。设想一下，如果CAR-T细胞在攻击肿瘤细胞的同时，还能随身携带并释放一种“解药”，专门中和PD-L1的抑制作用，那么其战斗力将可能得到极大提升。
正是在这样的背景下，泰国清迈大学联合医学科学学院的研究团队在《Biomedicine 》上发表了一项创新性研究。他们致力于开发一种“双管齐下”的CAR-T细胞，不仅能够精准识别并攻击表达FRα的肺癌细胞，还能主动分泌一种能够阻断PD-L1的单链抗体片段（scFv），从而在局部解除肿瘤的免疫抑制屏障。这种新型的CAR-T细胞被设计为第五代CAR（抗FRα-CAR5），旨在为肺癌患者提供一种更有效的个性化细胞免疫治疗方案。
为了验证这一设想，研究人员运用了多项关键技术。他们首先通过分子克隆技术构建了能够表达抗FRα-CAR4（作为对照）和抗FRα-CAR5（包含分泌性抗PD-L1 scFv）的慢病毒载体。随后，利用慢病毒转导技术，将这两种CAR基因导入从健康捐献者外周血单核细胞（PBMCs）中分离并激活的T淋巴细胞中，成功制备出CAR-T细胞。研究团队还通过流式细胞术详细表征了肺癌细胞系（A549, H1975, HCC827）的FRα和PD-L1表达水平，以及CAR-T细胞本身的表型。核心的功能性实验包括：短期（24小时）细胞毒性杀伤实验，用于评估CAR-T细胞对不同肺癌细胞的即时杀伤效果；CFSE增殖实验，用于检测CAR-T细胞在肿瘤细胞刺激下的分裂扩增能力；以及更为关键的长期（9天）抗原再攻击实验，通过连续三轮的肿瘤细胞共培养，模拟体内持续的抗原刺激和免疫抑制压力，以评估CAR-T细胞的持久战斗力和抗耗竭能力。
2.1. Construction of anti-FRα-CAR4 and anti-FRα-CAR5 lentiviral vectors
研究人员成功构建了含有抗FRα-CAR4和抗FRα-CAR5基因的慢病毒载体。抗FRα-CAR5的设计是在CAR4骨架的基础上，通过T2A序列连接了源自atezolizumab（一种已获批的PD-L1抑制剂）的抗PD-L1 scFv基因，从而使CAR-T细胞能够同时表达靶向FRα的CAR蛋白和分泌抗PD-L1的scFv蛋白。转染HEK293T细胞后，流式细胞术检测证实两种CAR均能在细胞表面有效表达。
2.2. Analysis of anti-PD-L1 scFv protein expression and binding activity
实验证明，转染了抗FRα-CAR5的HEK293T细胞能够分泌出具有生物活性的抗PD-L1 scFv。该scFv能特异性地结合到高表达PD-L1的HCC827肺癌细胞表面，其结合效率与阳性对照相当，而对照载体（抗FRα-CAR4）的培养上清液则无此结合能力。
2.3. Anti-PD-L1 scFv secreted from the anti-FRα-CAR5 construct inhibits PD-L1 specific monoclonal antibody binding
进一步的竞争性结合实验表明，抗FRα-CAR5细胞分泌的scFv能够有效占据肺癌细胞表面的PD-L1蛋白，从而竞争性地抑制后续加入的商业化抗PD-L1单克隆抗体与PD-L1的结合。这直接证明了所分泌的scFv具有功能性阻断活性。
2.4. Generation of human anti-FRα-CAR4 and anti-FRα-CAR5 T cells
研究成功地从12名健康捐献者的PBMCs中制备出抗FRα-CAR4和抗FRα-CAR5 T细胞。流式细胞术分析显示，两种CAR-T细胞的转导效率均达到约40%，且其免疫表型（如CD4+/CD8+比例、记忆亚群分布）与未转导的T细胞相比发生了预期的变化，但两种CAR-T细胞之间无显著差异，表明额外表达抗PD-L1 scFv并未影响T细胞的基本特性。
2.5. Antigen-specific cytotoxicity of anti-FRα-CAR4 and anti-FRα-CAR5 T cells
细胞毒性实验结果显示，两种CAR-T细胞均能特异性杀伤表达FRα的肺癌细胞系H1975（FRαLow/PD-L1Med）和HCC827（FRαHigh/PD-L1High），而对不表达FRα的A549（FRαNeg/PD-L1Low）细胞则无显著杀伤作用，证明了靶向特异性。关键发现在于，在面对高表达PD-L1的HCC827细胞时，抗FRα-CAR5 T细胞在较低的效靶比（E:T ratio，如2.5:1和1:1）下，其杀伤活性显著优于抗FRα-CAR4 T细胞，提示分泌的抗PD-L1 scFv有效缓解了PD-L1介导的抑制。
2.6. Monitoring anti-FRα-CAR4 and anti-FRα-CAR5 T cell proliferation in response to lung cancer cells
增殖实验表明，在与HCC827或H1975细胞共培养后，抗FRα-CAR5 T细胞均表现出强劲的增殖能力。特别是在与表达中等水平PD-L1的H1975细胞共培养时，只有抗FRα-CAR5 T细胞显示了显著的增殖优势，而抗FRα-CAR4 T细胞的增殖则被抑制，这再次凸显了PD-L1阻断在维持CAR-T细胞功能中的重要性。
2.7. The sustained antitumor activity of anti-FRα-CAR5 T cells after antigenic re-challenging against PD-L1+cancer cells
长期抗原再攻击实验是本研究的一大亮点。在连续三轮、为期9天的与高表达PD-L1的HCC827细胞的反复较量中，尽管两种CAR-T细胞表面的CAR表达量都因激活而显著下降，但抗FRα-CAR5 T细胞在整个实验期间都保持了显著高于未转导T细胞和抗FRα-CAR4 T细胞的杀伤活性。这表明，分泌抗PD-L1 scFv的功能赋予了CAR-T细胞更强的持久力和抵抗耗竭的能力，使其在严峻的免疫抑制环境中能持续发挥抗肿瘤作用。
综上所述，这项研究成功地开发并验证了一种新型的第五代CAR-T细胞——抗FRα-CAR5。该细胞创新性地将靶向FRα的肿瘤杀伤能力与局部分泌PD-L1阻断scFv的免疫抑制逆转功能融为一体。实验数据充分证明，这种设计能有效克服肺癌肿瘤微环境中PD-L1介导的免疫抑制，显著增强CAR-T细胞在体外模型中的细胞毒性、增殖能力以及长期抗肿瘤活性。尽管研究也观察到CAR-T细胞在持续激活后存在CAR表达下调的现象，这提示未来的研究需要进一步优化CAR结构的稳定性，但抗FRα-CAR5 T细胞所展现出的巨大潜力是毋庸置疑的。该策略为推进CAR-T细胞疗法在非小细胞肺癌等实体瘤中的应用提供了强有力的实验依据和新的思路，有望成为未来肿瘤免疫治疗领域一个重要的研究方向。
