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1. 晚期非小细胞肺癌患者基线血浆IL-6水平升高显著预测化疗免疫治疗抵抗及不良预后，通过小鼠模型和单细胞测序证实IL-6驱动免疫抑制微环境形成，表现为促肿瘤巨噬细胞极化、细胞毒性T细胞浸润减少及NK细胞功能受损。
杨雅宁|刘成明|杨璐|郑素菲|徐海燕|张书阳|田琳燕|孙楠|何杰|王燕
中国医学科学院/北京协和医学院国家癌症中心/国家癌症临床研究中心/癌症医院肿瘤内科，北京100021
摘要
一线化疗联合免疫疗法的原始耐药性仍是治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的显著挑战。尽管细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）与免疫检查点抑制剂（ICI）单药治疗的耐药性有关，但其对化疗联合免疫疗法结果的预测价值及潜在机制尚不明确。本研究探讨了基线血浆IL-6水平的预后意义以及该细胞因子在塑造NSCLC肿瘤免疫微环境（TIME）中的作用。我们回顾性分析了123名接受抗PD-1抑制剂联合化疗治疗的晚期NSCLC患者的数据，通过ELISA检测基线血浆IL-6水平，并使用Kaplan-Meier法和Cox回归分析评估无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。我们建立了IL-6过表达（IL6a）或抑制（IL6i）的小鼠肺腺癌（LLC）和鳞状细胞癌（KLN205）模型，并对其施以抗PD-1疗法±化疗。监测肿瘤生长，并对肿瘤浸润免疫细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。结果显示，基线血浆IL-6水平高的患者（>7.002 pg/mL）的无进展生存期（中位数：7.20个月 vs 16.63个月，P=0.001）和总生存期（中位数：15.63个月 vs 32.80个月，P=0.001）明显较差。高IL-6水平是较差无进展生存期（HR=2.42，P<0.001）和总生存期（HR=2.96，P<0.001）的独立预测因子，并与疾病进展（PD）相关（P=0.018）。在小鼠模型中，IL-6过表达降低了抗PD-1疗法联合化疗的抗肿瘤效果。此外，scRNA-seq分析显示，IL-6过表达使巨噬细胞极化偏向免疫抑制表型（以Hilpda和Nr4a1表达为特征），同时减少了细胞毒性CD8+ T细胞的比例，增加了调节性T细胞（Tregs）的比例。相反，IL-6抑制促进了免疫刺激型巨噬细胞表型（以Ccl8表达增加为特征），并增强了CD8+ T细胞的浸润和功能。高IL-6水平还与NK细胞脱颗粒途径受损相关。这些发现表明，基线血浆IL-6水平升高是接受一线化疗联合免疫治疗的晚期NSCLC患者原始耐药性和不良预后的强大独立预测因子。从机制上讲，IL-6通过促进肿瘤相关巨噬细胞极化来驱动免疫抑制性TIME的形成，进而抑制细胞毒性T细胞浸润，促进Treg扩增，并损害NK细胞功能，表明靶向IL-6是克服化疗联合免疫疗法耐药性的有希望策略。
引言
非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的恶性肿瘤之一，仍然是全球癌症相关死亡的主要原因[1]。对于晚期NSCLC患者，5年生存率仍低于20%。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs），特别是与化疗联合使用时，显著改善了生存结果，并已成为晚期NSCLC的标准一线治疗[2]，[3]，[4]，[5]，[6]，但仍有相当比例的患者出现原始耐药性或疾病快速进展。因此，识别可靠的生物标志物以预测化疗联合免疫疗法的有效性至关重要。目前，PD-L1表达是首个获得FDA批准的pembrolizumab伴随诊断生物标志物[5]，[6]。然而，其预测价值受到检测变异性、不一致的临界值以及肿瘤组织难以获取等因素的限制[7]。其他生物标志物，如肿瘤突变负担和微卫星不稳定性也存在实际和技术上的限制。在这种情况下，血浆检测因其微创性和适合纵向监测而成为一种有前景的替代方法。因此，发现有效的血浆生物标志物对于优化基于ICI的疗法至关重要。
细胞因子是免疫调节和炎症的关键介质[8]，[9]，[10]，[11]。其中，白细胞介素-6（IL-6）是一种多效细胞因子，参与炎症、免疫反应和造血过程，并逐渐受到作为潜在预后标志物的关注[12]，[13]。IL-6可以由多种细胞分泌和释放，包括白细胞、基质细胞和骨骼肌细胞。在肿瘤微环境中，IL-6的主要来源是肿瘤细胞、基质细胞和浸润的免疫细胞，包括成纤维细胞、MDSCs、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和CD4+ T细胞[14]，[15]。在我们之前的研究中，我们报告IL-6可能是接受ICI单药治疗的晚期NSCLC患者的强大预测标志物[16]。
最近发表的几项研究探讨了IL-6水平与化疗联合免疫疗法疗效之间的关系。较低的基线血清IL-6水平与改善的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关[17]，[18]，[19]。在我们之前的研究中，我们报告IL-6可通过JAK1-Stat3信号通路上调PD-L1表达。此外，升高的IL-6水平与接受抗PD-1单药治疗的患者的CD8+ T细胞浸润减少和髓系来源的抑制细胞（MDSCs）、M2巨噬细胞及调节性T细胞（Tregs）数量增加有关，从而共同导致免疫耐药性[16]。其他研究也有类似发现；具体来说，IL-6会损害细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的效应分化，并激活CTL内在的IL-6信号通路，从而降低抗PD-L1疗法的疗效[20]。在胰腺导管腺癌中，双重阻断IL-6和PD-L1已被证明可以增强效应T淋巴细胞的肿瘤内浸润[21]。更深入地了解IL-6在塑造NSCLC免疫微环境中的作用，有助于优化化疗联合免疫疗法的患者分层，并促进针对IL-6的治疗策略的开发。
鉴于其潜在的治疗相关性，IL-6在非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中的作用值得进一步研究。在本研究中，我们探讨了基线血浆IL-6水平与接受ICI联合化疗治疗的NSCLC患者临床结果之间的关联。在我们之前的工作中，我们证明了肿瘤来源的IL-6可通过系统循环塑造PD-L1阳性、TIL减少的肿瘤微环境[16]。因此，我们构建了IL-6高表达的小鼠模型，以确定IL-6在化疗联合免疫疗法耐药性中的作用。我们还通过单细胞测序在小鼠模型中探讨了IL-6调节ICI反应或导致耐药性的潜在机制。值得注意的是，这项研究强调了IL-6作为联合免疫疗法治疗靶点的潜力，为NSCLC的新治疗策略开发奠定了基础。
患者招募和疗效评估
本研究回顾性地纳入了2018年9月20日至2021年12月31日期间在中国人民解放军总医院（CHCAMS，北京）接受抗PD-1抑制剂联合化疗治疗的123名晚期NSCLC患者。患者每2或3周接受一次免疫治疗，nivolumab每两周给药一次，其他抗PD-1药物每3周给药一次。
基线血浆IL-6水平高的患者在化疗联合免疫治疗后预后较差
本研究共纳入123名接受ICI联合化疗治疗的晚期NSCLC患者（表S2）。其中63名（51.2%）被诊断为LUAD，52名（42.3%）被诊断为LUSC，8名（6.5%）被诊断为其他癌症（如肺腺鳞癌）。所有患者均接受了抗PD-1抗体联合化疗（表S3）。治疗反应评估显示，48名患者（39.0%）达到部分缓解（PR），71名（57.7%）
讨论
尽管化疗联合免疫疗法已成为晚期NSCLC的标准一线治疗，但原始耐药性仍然不可避免。本研究表明，高血浆IL-6水平是接受化疗和免疫治疗的NSCLC患者的不良预后指标。基于我们之前的研究，IL-6过表达的肿瘤具有PD-L1+/TIL-的肿瘤环境特征。为了进一步研究IL-6对免疫疗法疗效的影响，我们建立了小鼠模型
结论
我们的研究表明，血浆中IL-6水平升高预示着接受一线化疗联合免疫治疗的晚期NSCLC患者的不良预后。我们随后确认，IL-6高表达的小鼠模型对化疗联合免疫疗法的反应较差，进一步表明IL-6是影响肺癌腺癌和肺癌鳞状细胞癌患者治疗结果的独立因素。我们使用单细胞测序进行了深入研究
CRediT作者贡献声明
王燕：撰写 – 审稿与编辑、方法学、概念构思。何杰：监督、资金获取。张书阳：数据管理。徐海燕：方法学、数据管理。孙楠：监督、资金获取。田琳燕：正式分析、数据管理。刘成明：正式分析、数据管理、概念构思。杨雅宁：撰写 – 原稿撰写、正式分析、数据管理。郑素菲：研究、数据管理。杨璐：资金获取、正式分析，
伦理批准和参与同意
CICAMS伦理委员会批准了人体组织研究方案，批准号为19/147-1925。所有NSCLC样本均是在提供知情同意的情况下获取的。北京大学第三医院伦理委员会批准了动物实验，批准号为A2022063。
数据和材料的可用性
支持本研究结果的数据可向相应作者请求获得。本文报告的原始序列数据已存放在BIG数据中心的基因组序列档案库（PRJCA001214）中。
出版同意
作者声明与本研究、作者身份和/或文章的发表无关的潜在利益冲突。
资助
作者披露了以下财务支持用于本研究、作者身份和/或文章的发表：本项工作得到了国家自然科学基金（NSFC）[项目编号82202992]、青年科学基金（C类）、中央高校基本科研业务费（3332024048）、北京西溪临床肿瘤研究基金会（Y-Young2024-0346）以及国家级高水平医院临床研究资助和合作
致谢
作者感谢所有参与本研究的患者及其家属。我们还要感谢Abudureyimujiang Aili提供的技术支持。
