《COMPARATIVE Cytogenetics》：?Phylogenetic conservation and diversification of 18S rDNA loci in leaf-cutting ants (Hymenoptera, Formicidae): insights from molecular validation and chromosomal mapping using FISH
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本研究针对膜翅目昆虫细胞遗传学研究中广泛使用的18S rDNA探针进行分子验证，并在两种未研究的切叶蚁（Acromyrmex ambiguus和Ac. crassispinus）中首次提供基于FISH的染色体定位数据。研究证实了每个物种rDNA位点数量的保守性，但揭示了染色体位置的谱系特异性变异，包括亚端粒和着丝粒周围排列。系统发育信号分析表明rDNA定位存在非随机模式，为切叶蚁染色体进化模型提供了新见解，并证明了rDNA作为细胞分类学标记和进化标记的实用性。
在昆虫染色体进化研究中，核糖体DNA（rDNA）簇作为重要的细胞遗传学标记，既能用于物种分类界定，也能揭示染色体演化规律。然而，尽管rDNA探针在膜翅目昆虫细胞遗传学研究中被广泛应用，其分子特性却缺乏系统验证，这给实验结果的标准化和可重复性带来挑战。特别是在生态特化的切叶蚁群体（包括Acromyrmex、Amoimyrmex和Atta属）中，虽然45S rDNA位点的分布已有相对完善的记录，但rDNA定位的系统发育结构及其与染色体多样化的关系尚不明确。
为解决这一问题，研究人员开展了一项整合分子生物学、细胞遗传学和系统发育分析的综合研究。他们首先对常用于新热带区膜翅目研究的18S rDNA探针进行分子表征和验证，通过测序确认其特异性，并将该探针应用于两种此前未研究的切叶蚁物种（Acromyrmex ambiguus和Ac. crassispinus）的染色体定位分析。
研究团队采用的主要技术方法包括：从预蛹期幼虫脑神经节制备染色体标本，通过聚合酶链式反应（PCR）从蚂蚁基因组DNA中扩增18S rDNA片段，利用荧光原位杂交（FISH）技术进行染色体定位，并对PCR产物进行测序和BLASTn分析验证探针特异性。样本来源于巴西米纳斯吉拉斯州和圣保罗州野外采集的蚁群，同时结合已发表的细胞遗传学数据进行系统发育信号分析。
FISH探针表征
研究人员通过对蚂蚁基因组DNA进行PCR扩增，获得了长度约741-750 bp的18S rDNA探针片段。序列比对显示，该探针对应于18S基因的初始片段，起始于Aphelinus gossypii完整18S基因的第80位位置。BLASTn分析证实了探针的高度特异性，与蚂蚁18S rDNA序列的相似性达到99%，验证了其适用于细胞遗传学定位研究。碱基组成分析显示各序列中A、T、C、G比例均衡，虽然Melipona属探针中胸腺嘧啶略有富集，但这种微小偏差不会影响标记效率。
切叶蚁中18S rDNA的特征
应用FISH技术对Acromyrmex和Amoimyrmex属切叶蚁的45S rDNA进行染色体定位发现，Acromyrmex crassispinus和Ac. ambiguus的核型均由38条染色体组成，主要为亚端着丝粒染色体，单个45S rDNA簇始终位于最大亚端着丝粒对短臂的端粒区域。而Amoimyrmex bruchi和Am. silvestrii的二倍体染色体数为22条，主要为中部着丝粒染色体，45S rDNA位点位于第二对中部着丝粒染色体的中间区域。这些发现反映了研究类群中rDNA位点数量保守但位置可变的特征。
rDNA信号代码的系统发育结构
通过整合自身FISH实验数据和已发表文献，研究人员发现切叶蚁18S rDNA的染色体定位呈现清晰的系统发育模式。大多数Acromyrmex物种显示ST1-t信号（第一亚端着丝粒对端粒位置），而Atta物种 consistently呈现M4-i信号（第四中部着丝粒对中间位置）。Amoimyrmex物种则显示M2-i信号（第二中部着丝粒对中间位置）。信号代码在系统发育树上的分布非随机，亲缘关系相近的物种共享相同的rDNA定位模式。在等速率（ER）模型下，状态间转换率对称（q≈0.00685），log-likelihood=-10.09，AIC=22.17。
祖先状态重建支持rDNA定位模式具有系统发育结构的假设，间质定位在一些Atta和Amoimyrmex物种中表现为祖先状态并得以保留，而端粒定位可能是Acromyrmex中的衍生状态。ST1-t信号与分化时间呈显著正相关（r=0.57；p=0.009），支持该定位是Acromyrmex内的衍生条件。这些发现表明18S rDNA定位具有系统发育信息性，反映了切叶蚁内保守和谱系特异性的核型进化。
研究结论表明，虽然rDNA位点数量在切叶蚁各属间保持保守（每个单倍体基因组一个位点），但其染色体定位表现出明显的谱系特异性模式：Acromyrmex中为端粒定位，Amoimyrmex中为间质定位，Atta中为着丝粒周围定位。这些定位模式具有系统发育结构，每种rDNA构型限制于特定属内，尽管采样有限仍检测到明显的系统发育信号。通过在不同染色体区室（如端粒、着丝粒和间质区域）定位rDNA位点，证明rDNA位点可作为推断真菌种植蚁染色体区室进化的 informative 细胞遗传学标记。
该研究的意义在于深化了对rDNA位点双重角色的理解：既是稳定的细胞遗传学标志物，又是反映谱系特异性染色体进化的动态基因组元件。rDNA位点的位置动力学可能对核仁组织和核架构产生功能影响，在Amoimyrmex和Atta等谱系中，rDNA consistently位于间质或着丝粒周围区域可能通过促进稳定的核仁架构和降低染色体不稳定性风险而具有选择优势。相反，Acromyrmex中观察到的端粒定位可能与更大的核型可塑性相关，可能促进该属的染色体多样化。这些发现为理解昆虫染色体进化机制提供了重要见解，并为未来整合染色质拓扑结构、基因表达动力学和扩展系统发育采样的研究奠定了基础。
