《Drug Resistance Updates》：Generation and characterisation of a humanised GLP-1 receptor mouse model for translational drug development
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为克服肽类GLP-1受体激动剂(GLP1RA)需皮下注射、患者依从性差等局限，口服小分子GLP1RA的研发成为热点，但其对啮齿类GLP1R无活性限制了临床前评估。本研究利用CRISPR-Cas9技术成功构建并系统验证了人源化GLP1R (hGLP1R)小鼠模型。研究证实，该模型能准确模拟人受体药理学，小分子GLP1RA orforglipron在该模型中展现出与肽类激动剂semaglutide相当的降糖、减重及中枢激活功效，为肥胖、糖尿病等代谢性疾病的新药研发提供了强大的转化平台。
在全球肥胖和2型糖尿病流行的大背景下，胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂(GLP1RAs)已成为一类革命性的治疗药物。肽类GLP1RAs，如司美格鲁肽(Semaglutide)，虽然疗效显著，但其低口服生物利用度使得患者必须接受皮下注射，这带来了依从性、储存便利性和可及性等多重挑战。尽管口服司美格鲁肽片剂已获批，但其给药方案复杂且成本较高。这些局限性极大地推动了口服生物可利用的非肽类（小分子）GLP1RAs的研发，例如奥福格列蓬(Orforglipron)和达努格列蓬(Danuglipron)。然而，小分子GLP1RAs的研发面临一个关键瓶颈：它们对小鼠GLP1R几乎没有活性，其激活依赖于人类GLP1R细胞外域中第33位色氨酸(W33)这一灵长类特异性残基，而小鼠该位置是丝氨酸。这种物种特异性的受体药理学使得标准啮齿类动物模型无法准确预测小分子GLP1RAs在人体内的反应，严重阻碍了此类药物的临床前开发。
为了解决这一转化鸿沟，研究人员开展了一项旨在构建并全面验证一种人源化GLP-1受体(hGLP1R)小鼠模型的研究。该研究的目标是建立一个能够更准确再现人类受体药理学特征的平台，从而提升其在临床前药物开发中的实用性。这项研究成果已发表在《Drug Resistance Updates》杂志上。
为了开展研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建hGLP1R敲入小鼠模型；通过免疫组织化学法验证人源和鼠源GLP1R在胰腺和脑组织的表达；采用离体胰腺β细胞cAMP积累测定法评估激动剂功能；进行口服和腹腔葡萄糖耐量试验以评估血糖控制；利用自动化系统实时监测摄食量、饮水量和自发活动；通过条件性味觉厌恶实验评估药物引起的厌恶反应；使用对乙酰氨基酚吸收试验检测胃排空速率；应用高分辨率三维全脑光片荧光显微成像技术结合深度学习分析，定量绘制脑内c-Fos激活图谱（一种神经元活动标志物），以揭示药物作用的中枢神经回路。
免疫组织化学验证hGLP1R小鼠中人源化受体的表达
研究人员首先利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将内源性小鼠Glp1r基因替换为人类GLP1R cDNA，成功构建了hGLP1R小鼠模型。通过特异性抗体进行免疫组织化学染色分析，结果显示，在野生型(WT)小鼠的胰腺β细胞岛以及下丘脑弓状核(ARH)、最后区(AP)和孤束核(NTS)等关键食欲调节脑区，均能检测到强烈的鼠源GLP1R信号。与之形成鲜明对比的是，在纯合hGLP1R小鼠的上述组织中，鼠源GLP1R表达完全缺失，同时呈现出清晰的人源GLP1R表达。这从蛋白水平证实了人源受体在关键外周和中枢组织的成功表达与鼠源受体的有效敲除。
肽类与小分子GLP1RAs在hGLP1R小鼠离体胰腺胰岛cAMP产生中的差异功效
葡萄糖刺激的cAMP产生是β细胞胰岛素分泌的关键上游信号。为了评估人源化GLP1R的功能，研究人员比较了肽类激动剂（GLP-1 (7–37)和司美格鲁肽）与小分子激动剂（奥福格列蓬和达努格列蓬）在离体培养的WT和hGLP1R小鼠胰腺β细胞中的cAMP反应曲线。结果显示，GLP-1 (7–37)和司美格鲁肽在两种基因型小鼠的β细胞中均表现出相似的效价(EC50)和最大反应(Emax)。然而，奥福格列蓬和达努格列蓬在WT小鼠的β细胞中即使浓度高达10 μM也完全无活性，这与它们对人GLP1R的选择性一致。在hGLP1R小鼠的β细胞中，这两种小分子化合物则显示出与肽类激动剂相当的效价，但均未达到完全激动剂的功效，其中达努格列蓬的最大cAMP反应高于奥福格列蓬。
司美格鲁肽和奥福格列蓬改善hGLP1R小鼠的葡萄糖耐量
研究人员随后进行了一系列体内实验来系统表征司美格鲁肽和奥福格列蓬在普通饮食喂养小鼠中的代谢功效。腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)显示，司美格鲁肽(10 nmol/kg)能显著降低WT和hGLP1R小鼠的基础血糖和葡萄糖输注期间的血糖水平。相反，奥福格列蓬(1 mg/kg)对WT小鼠的葡萄糖曲线没有影响，但能显著改善hGLP1R小鼠的血糖水平，效果与司美格鲁肽相当。在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)中，两种化合物在hGLP1R小鼠中也显示出相似的抑制餐后血糖升高的能力。此外，在单独的IPGTT研究中，司美格鲁肽(30 nmol/kg)和奥福格列蓬(3.0 mg/kg)在hGLP1R小鼠中表现出相当的刺激胰岛素分泌的功效。
司美格鲁肽和奥福格列蓬降低hGLP1R小鼠的体重和摄食量
GLP1RAs主要通过抑制食欲来促进体重减轻。研究人员在黑暗期开始前单次给予司美格鲁肽(10 nmol/kg)或奥福格列蓬(3.0 mg/kg)，并监测24小时内的代谢参数。结果显示，司美格鲁肽能在WT小鼠中引起显著的基线校正后体重下降和累积摄食量、饮水量及自发活动的抑制。而在hGLP1R小鼠中，奥福格列蓬和司美格鲁肽对这些代谢参数产生了可比拟的抑制作用。值得注意的是，司美格鲁肽在hGLP1R小鼠中对摄食量、饮水量和自发活动的总体影响弱于在WT小鼠中的效果。
司美格鲁肽和奥福格列蓬在hGLP1R小鼠中诱导条件性味觉厌恶
恶心和呕吐是GLP1RAs常见的副作用。在条件性味觉厌恶(CTA)实验中，使用顺铂(Cisplatin)作为阳性对照，评估药物的厌恶效应。结果显示，司美格鲁肽(10 nmol/kg)在WT和hGLP1R小鼠中均能引发强烈的厌恶反应，效果与顺铂相当。重要的是，奥福格列蓬(3.0 mg/kg)在WT小鼠中不诱导CTA，但在hGLP1R小鼠中则产生与司美格鲁肽程度相当的显著厌恶效应，表明其厌恶特性依赖于hGLP1R的表达。
司美格鲁肽而非奥福格列蓬在hGLP1R小鼠中持续延迟胃排空
GLP1RAs通过抑制胃排空来改善血糖控制和减少能量摄入。通过检测口服对乙酰氨基酚后的血清吸收速率来评估胃排空。研究发现，司美格鲁肽(10 nmol/kg)能有效延迟WT小鼠的胃排空，但在hGLP1R小鼠中的抑制作用较弱。相比之下，奥福格列蓬（即使在30 mg/kg的高剂量下）对WT或hGLP1R小鼠的胃排空均未产生一致性的影响。
司美格鲁肽和奥福格列蓬在DIO（饮食诱导肥胖）小鼠中促进相当的体重减轻
在高脂饮食诱导的肥胖(DIO)模型中，研究人员比较了司美格鲁肽和奥福格列蓬的减重功效。经过4周每日一次的治疗，司美格鲁肽(30 nmol/kg)在WT DIO小鼠中引起的体重减轻(-18.0%)显著大于在hGLP1R DIO小鼠中的效果(-8.1%)。奥福格列蓬在WT DIO小鼠中无效，但在hGLP1R DIO小鼠中能剂量依赖性地降低体重(0.3 mg/kg: -4.6%; 3.0 mg/kg: -12.9%)，其摄食量减少也与体重下降相符。在hGLP1R DIO小鼠中，司美格鲁肽和奥福格列蓬(3.0 mg/kg)引起的体重减轻和摄食量减少程度相当。停药两周后，司美格鲁肽治疗组出现了补偿性能量摄入增加和体重的近乎完全反弹，而奥福格列蓬停药后的体重反弹程度较轻。在血浆脂质方面，司美格鲁肽能显著降低WT和hGLP1R DIO小鼠的总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，而奥福格列蓬仅改善hGLP1R小鼠的血脂参数，高剂量时效果与司美格鲁肽相当。
司美格鲁肽和奥福格列蓬在hGLP1R小鼠中募集食欲调节神经回路
为了深入探究中枢作用机制，研究人员利用三维全脑c-Fos成像技术，在给药2小时后比较了司美格鲁肽和奥福格列蓬在WT和hGLP1R小鼠中的全脑激活模式。结果显示，司美格鲁肽在WT和hGLP1R小鼠中均能显著增加关键食欲调节脑区的c-Fos阳性细胞数量，包括中央杏仁核(CEA)、丘脑底旁核(PSTN)、臂旁核(PB)、孤束核(NTS)、迷走神经背核(DMX)以及最后区(AP)。奥福格列蓬在WT小鼠中不诱导c-Fos表达，但在hGLP1R小鼠中显著激活了终纹床核(BST)、CEA和PB，其激活水平与司美格鲁肽相当。奥福格列蓬在丘脑室旁核(PVT)也引起轻微激活，但在NTS和DMX中未诱导显著c-Fos表达。
该研究通过多模态实验设计，全面评估了hGLP1R小鼠模型，并直接对比了肽类GLP1RA司美格鲁肽和小分子GLP1RA奥福格列蓬在多种药效学终点上的功效。研究结论明确指出，成功构建的hGLP1R小鼠模型能够准确模拟人GLP1R的药理学特征。奥福格列蓬在该模型中展现出与司美格鲁肽相当的降血糖、减轻体重、抑制食欲以及激活特定中枢食欲调节回路的能力，而这些效应在表达鼠源GLP1R的野生型小鼠中完全缺失。此外，两种激动剂在诱导味觉厌恶和影响胃排空等方面表现出不同的特征。这些发现不仅揭示了肽类与非肽类GLP1RAs之间不同的功效特征，更重要的是，它们确立了hGLP1R小鼠模型作为一个稳健且高度转化相关的临床前平台的价值。该模型极大地弥补了当前小分子GLP1RAs研发中的物种差异鸿沟，为推进针对肥胖、2型糖尿病及相关代谢性疾病的新一代GLP1R靶向疗法的发现和评估提供了关键工具。这项研究对于加速更便捷、可及性更高的口服抗肥胖和抗糖尿病药物的开发具有重要的科学意义和临床转化价值。
