《Fish & Shellfish Immunology》：Rab6 mediates lysosome biogenesis to regulate phagocytosis and bacterial clearance in the Chinese mitten crab
Eriocheir sinensis
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Rab6 GTP酶通过调控血细胞吞噬体-溶酶体融合增强中国绒螯蟹抗 bacterial challenge能力。RNA干扰沉默EsRab6导致血细胞吞噬效率下降、溶酶体信号减弱，感染后存活率降低。该研究首次揭示绒螯蟹Rab6在溶酶体形成中的关键作用，为水产免疫调控提供新靶点。
何新宇|李玉曦|万新月|郝庆鼎|李阳|沈国清|周凯敏|李伟伟|王群|朱友婷
教育部水生遗传资源勘探与利用重点实验室，上海海洋大学，上海，201306，中国
摘要
循环血细胞的吞噬作用对甲壳类的抗菌防御至关重要，但细胞内GTP酶如何协调这一过程仍知之甚少。在这里，我们从中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）中鉴定并表征了一种Rab6同源物（EsRab6），并定义了其在血细胞吞噬和抵抗Vibrio parahaemolyticus中的作用。EsRab6编码一种典型的Rab6 GTP酶，具有保守的核苷酸结合基序和Rab家族特征，并属于无脊椎动物Rab6分支。该基因在多种组织中广泛表达，尤其是在肝胰腺和眼柄中含量较高；然而，在V. parahaemolyticus感染后，EsRab6在血细胞中的表达迅速增加但持续时间短暂。通过RNA干扰敲低EsRab6后，显微镜和流式细胞术显示血细胞对FITC标记的细菌摄取显著减少。免疫荧光和LysoTracker染色表明，在感染过程中EsRab6从分散的细胞质状态重新定位到与溶酶体共定位的囊泡中。同时，EsRab6的敲低显著降低了与溶酶体相关的信号，表明其在溶酶体形成或稳定性中起作用。体内实验显示，EsRab6的沉默导致血淋巴中的细菌负荷增加，V. parahaemolyticus感染后的存活率显著降低。总体而言，这些发现表明EsRab6是一种保守的转运调节因子，它将吞噬体-溶酶体的生成与甲壳类血细胞中的有效细菌清除联系起来，提示可以通过靶向Rab6相关通路来增强甲壳类水产品的疾病抵抗力。
引言
作为先天免疫的关键组成部分，吞噬作用是一种古老且高度保守的机制，用于清除入侵的病原体和凋亡细胞[1]。无脊椎动物主要依赖血细胞介导的细胞免疫，因此吞噬作用是重要的第一道防线[2]，[3]。这一过程的有效性是宿主控制感染和生存的关键因素[1]。在如Drosophila melanogaster等研究充分的模式生物中，研究表明吞噬作用涉及模式识别受体、细胞骨架重组和下游信号通路的复杂协调[3]，[4]。同样，在经济重要的甲壳类动物（如虾和蟹）中，充足的吞噬能力对于维持健康和抵抗严重的细菌感染（包括弧菌病）至关重要。血细胞对病原体的吞噬不仅仅是清除机制；它还触发了一个复杂的细胞内降解过程，将吞噬体成熟与溶酶体系统联系起来，从而破坏微生物[3]，[5]。因此，了解吞噬作用的分子调节因子对于扩展我们对无脊椎动物免疫的认识和发展创新的水产疾病管理策略至关重要。
吞噬体成熟是一个受空间和时间调控的过程，由小GTP酶控制，Rab（Ras相关结合）蛋白作为囊泡转运的关键调节因子[6]。D. melanogaster基因组编码了26种以上的Rab蛋白，其中许多在哺乳动物中具有功能保守性，突显了它们的进化重要性[7]。在吞噬过程中，不同的Rab蛋白在吞噬体成熟的各个阶段发挥作用：Rab5促进新形成的吞噬体与早期内吞体的融合[8]，[9]，而Rab7介导晚期内吞体-溶酶体的融合，这是吞噬体酸化和 cargo 降解的关键步骤[9]，[10]，[11]。其他Rab蛋白（如Rab4、Rab11和Rab10）以及retromer复合体协助将吞噬体成分回收至质膜或跨高尔基网络[12]。总体而言，Rab蛋白通过一系列有序的效应因子招募和膜重塑事件来协调吞噬作用[13]。典型的Rab5–Rab7转换体现了这种层次结构：GTP酶驱动的Rab5到Rab7的转换招募了特定的连接因子和可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）复合体，引导吞噬体与内吞体和溶酶体的顺序融合[14]，[15]，[16]，[17]。这种转换确保了病原体降解所需水解酶的及时输送[14]，[16]，[18]。尽管核心机制在很大程度上是保守的，但不同物种中个别Rab蛋白的具体功能可能有所不同[19]。在包括几种虾类在内的甲壳类动物中的研究表明，Rab5和Rab7在细菌清除中的作用是保守的[20]，[21]，[22]，[23]，[24]，[25]。然而，吞噬作用的具体调控机制仍不完全清楚，许多Rab家族成员在无脊椎动物免疫中的作用也仅部分了解。
在哺乳动物系统中，Rab6是最丰富的高尔基相关GTP酶之一，主要定位于高尔基囊泡、跨高尔基网络（TGN）和前往质膜的分泌囊泡[26]。它通过协调分泌载体的释放、移动和在质膜上的对接来调节持续分泌[27]。这一对接过程特别需要Rab6依赖的辅助因子（如ELKS、哺乳动物中的Rab6IP2、CAST2或ERC1）的招募[27]，[28]，[29]，[30]，[31]。除了其一般的分泌功能外，Rab6还参与多种细胞类型的特异性分泌过程。它通过促进TNF和MHC II类分子在巨噬细胞和B淋巴细胞表面的递送来支持免疫功能[32]，[33]，在神经元形态发生过程中指导外分泌载体的运输[34]，并在Drosophila中通过靶向递送皮质成分来实现卵细胞的极化[35]，[36]，并参与携带黑色素生成货物的高尔基来源囊泡的形成[37]。这些特异性功能突显了Rab6依赖性转运在各种生理环境中的多功能性。值得注意的是，Rab6在吞噬作用中的作用仍然引人关注但理解不足[19]，[23]。尽管Rab6通常与高尔基和跨高尔基网络（TGN）转运相关，但Rab6依赖的运输途径也可以与直接参与吞噬体成熟和吞噬体-溶酶体融合的内溶酶体系统相交。研究表明，Rab6在细菌感染期间也参与吞噬体成熟[38]。此外，在特定细胞环境中，Rab6介导的分泌转运可以被重新导向溶酶体相关器官[37]。虽然尚未在无脊椎动物中报道Rab6在溶酶体生成中的功能，但哺乳动物系统的证据表明它可能参与吞噬溶酶体的形成，这值得在甲壳类免疫细胞中进一步研究其作用。
鉴于吞噬作用在甲壳类免疫中的关键作用以及围绕Rab6的未解机制问题，我们对经济重要的养殖物种中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）中的Rab6进行了功能分析。在这项研究中，我们鉴定并克隆了其Rab6同源物（EsRab6），研究了其进化保守性，并评估了其在不同组织和细菌感染后的表达模式。通过RNAi介导的敲低以及流式细胞术和免疫荧光测定，我们证明了EsRab6对血细胞的有效细菌吞噬至关重要。进一步的成像显示EsRab6定位于吞噬区室并促进吞噬体-溶酶体融合。重要的是，体内感染实验表明EsRab6的缺失会阻碍细菌清除并降低宿主存活率。我们的发现确立了EsRab6作为甲壳类关键免疫调节因子的地位，提供了关于Rab6介导的吞噬溶酶体成熟的机制见解，并强调了其在增强水产疾病抵抗力方面的潜力。
实验动物
健康的E. sinensis个体，平均体重为65 ± 18克，来自中国江苏省苏倩市的黄墩湖工业发展有限公司的水产养殖场。在开始实验之前，这些螃蟹在23 ± 2 °C的充氧淡水中饲养了7天以适应环境。在此期间，每天喂食商业颗粒饲料，不使用抗生素。所有动物被随机分配到实验组中，以尽量减少潜在的采样偏差。
生物信息学分析
基因和
EsRab6的序列特征
通过使用BLAST搜索E. sinensis的全基因组测序数据库（GenBank: PRJNA737102），我们鉴定出一个全长cDNA（2726 bp），该cDNA编码一种Rab6 GTP酶（GenBank: XM_050880986.1）。然后我们从混合组织cDNA文库中克隆了这个cDNA。该序列包含一个639 bp的开放阅读框（ORF），编码一个212个氨基酸的蛋白质，估计分子量为23.81 kDa，我们将其命名为EsRab6
讨论
本研究通过对中华绒螯蟹（E. sinensis）中的Rab GTP酶进行功能表征，确定Rab6（EsRab6）是血细胞介导的吞噬作用和抗菌免疫的关键调节因子。我们的主要发现包括：（1）EsRab6是一种结构保守的GTP酶，其在细菌感染后血细胞中的转录显著增加；（2）体外和体内敲低EsRab6显著降低了血细胞的吞噬能力
作者贡献：CRediT
何新宇：研究、数据分析、软件使用、数据整理、初稿撰写。李玉曦：验证、生物信息学分析、软件使用。万新月：验证、数据分析、软件使用。郝庆鼎：方法学研究、软件使用。李阳：方法学研究。沈国清：方法学研究。周凯敏：方法学研究。李伟伟：撰写、审稿和编辑。王群：资源提供、撰写、审稿和编辑。朱友婷：概念提出、数据分析、监督、验证、撰写
资助
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：32373167）的支持。
致谢
我们感谢上海海洋大学渔业与生命科学学院提供的实验平台，为这项研究提供了必要的仪器。
