《Food Chemistry》：Microwave-assisted extraction enhances the epicatechin and bovine serum albumin the interaction by inducing protein conformational changes
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微波辅助提取对牛血清白蛋白与表没食子儿茶素结合结构的影响研究。采用低温度MAE技术，通过荧光淬灭光谱分析发现EC与BSA通过疏水作用静态结合，MAE显著降低结合常数并改变BSA二级结构，表现为α-螺旋减少及β-折叠等无序结构增加。该研究为低温MAE调控蛋白质构象与酚类相互作用提供了理论依据。
段文婷|袁江峰|王丽娟|孙梦雪|杨晓文|邱志军
河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳471023，中国
摘要
本研究评估了微波辅助提取（MAE）对牛血清白蛋白（BSA）与表儿茶素（EC）相互作用结构的影响。结果表明，EC通过静态猝灭作用自发地与BSA结合，这一过程主要由疏水相互作用驱动。在298 K的低温下进行MAE处理会降低EC-BSA复合物的稳定性（Ksv和Kb），并减弱单结合位点的结合亲和力。此外，MAE显著降低了BSA中的α-螺旋含量，同时增加了β-折叠、β-转角、无规卷曲和羰基团的含量，从而改变了BSA的结构特性并增强了其结构无序性。总之，低温MAE在影响BSA与EC的结合相互作用方面表现出一定的规律性，并可能诱导BSA的构象变化。这表明低温MAE可能为通过调节酚类化合物与蛋白质之间的相互作用来选择性地调控蛋白质构象和潜在生理功能提供重要的理论基础。
引言
微波是一种频率范围在300 MHz到300 GHz之间的电磁波。在微波照射下，极性分子会随着电场方向的快速变化（每秒24.5亿次）而旋转，从而改变其原有的随机热运动（Ekezie等人，2017年）。作为一种新兴的提取技术，微波辅助提取（MAE）近年来因其显著的优势而受到广泛关注，包括更短的提取时间、更高的产率、更低的能耗以及减少溶剂的使用（Guzik等人，2022年；Tang等人，2025年）。研究表明，MAE通过其直接的、体积性的和选择性的电磁加热机制，能够在提取过程中迅速诱导原料内部的结构破坏和压力积累，从而促进活性化合物的扩散和释放，有效加速提取过程（Mao等人，2023年）。在介电材料中，微波能量转化为热能主要通过两种机制实现：偶极子旋转和离子传导。通常，大多数生物质材料和水溶剂同时包含这两种机制，共同作用导致材料几乎瞬间加热（Soria等人，2015年）。微波加热可以同时作用于材料的内部和外部，避免了传统热传导中的能量损失，使其效率显著高于传统提取方法。然而，MAE仍面临一个长期的技术挑战：电磁场分布不均匀，容易导致材料部分过热或加热不足；低温提取有利于保持生物活性化合物（尤其是生物大分子）的结构和功能完整性；然而，关于如何利用微波技术实现低温提取的系统研究相对较少；大多数现有的微波提取系统采用负反馈温度控制，当实际温度达到设定值时，磁控管的输出功率和操作频率会急剧下降，因此难以准确评估和记录微波辐射的效果。基于这些问题，我们的研究小组开发了封闭式磁力搅拌器和可控温度冷却（CMCC-MI）系统（Yuan等人，2020年），以更精确地研究MAE对食品或草药中生物活性成分的影响。在MAE过程中，CMCC-MI系统保持了均匀的微波温度和恒定的样品体积。通过外部冷却剂持续去除微波处理溶液中产生的热量，该系统实现了连续稳定的微波功率输出。该系统能够精确控制微波温度和功率。
蛋白质提取方法在获得高质量蛋白质方面起着关键作用，因为它们显著影响提取蛋白质的组成、物理化学和功能特性。目前，常用的蛋白质提取方法有碱提取和酸沉淀法，但这些方法与较长的处理时间以及潜在的蛋白质变性和不良的功能特性相关（Wijethunga等人，2025年）。近年来，许多学者研究了微波对蛋白质结构、功能和质量的影响。例如，Thostenson和Chou（1999年）提出微波产生的电磁场会在蛋白质内部引发分子摩擦，可能导致共价或非共价键的断裂；Calabrò和Magazù（2016年）发现1765 MHz的微波增强了蛋白质的平行β-折叠振动带（Calabrò & Magazù，2016年）。Tao等人（2024年）利用分子动力学模拟和分子对接技术研究了微波对转谷氨酰胺酶与其底物结合机制的影响；Jiao等人（2024年）探讨了微波加热对鱼肌纤维蛋白聚集行为的影响；我们的研究小组（Yuan等人，2021年；Yuan等人，2024年）发现微波技术通过生成碳中心自由基调节了多酚氧化酶和β-葡萄糖苷酶的结构和功能。需要强调的是，MAE的机制可能同时涉及热效应和非热效应（Cavalcante等人，2021年）；然而，准确区分这两种效应的贡献仍然是一个重大挑战。在MAE过程中，微波照射可能诱导自由基的形成（Fan等人，2016年；Yuan, Hou等人，2021年），这可能影响小分子（Yuan等人，2020年）和大分子（Fan等人，2016年；Yuan等人，2024年）的结构和功能。这些研究还表明，高温引起的蛋白质变性是MAE过程中需要考虑的关键因素。相比之下，我们团队开发的CMCC-MI系统由于具有低温操作和精确的功率输出控制等优点，可以有效防止高温引起的蛋白质变性。迄今为止，微波辐射影响蛋白质与小分子相互作用的机制尚未得到系统性的阐明或广泛理解。尽管如此，在MAE过程中，热效应和非热效应可能共同作用于蛋白质和小分子，对其结构和功能产生显著影响。为了避免高温引起的蛋白质变性，采用低温MAE研究蛋白质的结构和功能是一个明智的策略。
作为植物的次生代谢物，酚类化合物因其不同的功能特性而受到广泛关注（Krebs & Schummer，2024年）。然而，一些酚类化合物（如表儿茶素）通常与其他天然成分共存，这经常导致在分离和纯化过程中与其他成分共同提取，从而使分离过程变得更加复杂（Alara等人，2021年）。研究表明，在蛋白质提取过程中，pH值、温度和离子浓度等条件会影响蛋白质的物理化学特性（Wang, Li等人，2023年）。例如，碱性条件促进了酚类化合物与蛋白质之间的不可逆共价结合，从而改变了蛋白质的结构特性（Zhang等人，2021年）；相对较高的温度会引起蛋白质的构象变化，暴露出更多的疏水位点，进一步影响其性质（Quan等人，2019年）。此外，酚类化合物容易与蛋白质相互作用，其浓度和类型是影响蛋白质结构和功能差异的关键因素（Fan等人，2016年）。近年来，由于混合系统的提取成本低且操作简单，酚类化合物与蛋白质的相互作用引起了越来越多的研究兴趣。另一方面，许多富含蛋白质的材料含有内源性酚类化合物，表明蛋白质中存在大量的酚类结合位点（Yan等人，2023年）。
蛋白质与酚类化合物在提取过程中的相互作用复杂性源于它们在物种和浓度上的多样性。为了克服这一挑战，模型系统被广泛用于研究以阐明涉及的复杂反应机制。牛血清白蛋白（BSA）是一种结构明确、功能清晰的模型蛋白质，常用于实验室研究。表儿茶素（EC）作为一种典型的单体酚类化合物，广泛存在于各种药用植物和食品中（Bernatova，2018年）。本研究旨在通过分析低温MAE对猝灭机制、结合参数、热力学参数和蛋白质构象变化的影响，来探讨蛋白质与酚类化合物在温和模型溶液中的相互作用。本研究旨在探讨在复杂系统中低温MAE是否改变了大分子结构，从而通过调节小分子与大分子之间的相互作用影响其功能特性，本文为基于蛋白质与小分子相互作用的低温MAE开发提供了有价值的见解。
材料
BSA（≥98.0%）、EC（≥98.0%）和盐酸胍（≥99.0%）购自合肥博美生物技术有限公司。分析纯5,5′-二硫-(2-硝基苯甲酸）（DTNB）（98%）、邻苯二甲醛（OPA）（98%）、8-氨基-1-萘磺酸（ANS）（98%）和亮氨酸（≥99%）购自上海源业生物技术有限公司。NaOH（≥96.0%）、无水乙醇（≥99.7%）、β-巯基乙醇（99.0%）、甲醇（≥99.9%）和三氯乙酸（TCA）（≥99.0%）购自其他供应商。
MAE对EC-BSA荧光猝灭光谱的影响
BSA具有峰值约为340 nm的固有荧光发射光谱，主要来源于其色氨酸（Trp）残基（Mittal等人，2022年）。如图1A所示，随着EC结合量的增加，BSA的荧光强度呈下降趋势，表明EC与BSA之间的亲和力具有结构依赖性，EC结合了BSA的疏水氨基酸，在荧光猝灭过程中起着重要作用。
结论
MAE因其高效率、快速处理、良好的选择性和低能耗而受到广泛关注。本研究使用CMCC-MI系统研究了MAE对EC与BSA相互作用的影响，以克服微波场分布不均匀和输出功率不稳定的技术障碍。荧光猝灭分析显示，EC通过静态猝灭作用自发地与BSA结合，这一过程主要由疏水相互作用驱动。
作者贡献声明
段文婷：撰写——原始稿件、软件应用、方法学设计、数据管理。袁江峰：撰写——审稿与编辑、研究设计、概念构思。王丽娟：撰写——审稿与编辑。孙梦雪：方法学设计、数据管理。杨晓文：撰写——原始稿件、数据管理。邱志军：资源获取、研究协助。
未引用的参考文献
Buddanavar和Nandibewoor，2017
Chaudhuri等人，2006
Guo, Sun, Cheng和Han，2017
Kandagal等人，2006
Li和Hao，2015
Qin, Liu, Pan, Fang和Mou，2010
Rahman和Khalil，2022
Rahman和Khalil，2024
Ross和Subramanian，1981
Wang, Cheng和Keener，2023
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
