使用巯基化透明质酸-乳清蛋白复合物制备的益生菌封装体的稳定机制、细胞密度及其存活率：作为潜在的针对结肠的益生菌递送系统

《Food Research International》：Stabilization mechanisms, cell density, and survival of probiotic encapsulation prepared with thiolated hyaluronic acid-whey protein complex: For potential colon targeting probiotic delivery system

为提升乳酸乳球菌KLDS 4.0325在恶劣环境中的抗逆性，构建了新型硫醇化透明质酸（HASH）-乳清蛋白 isolate（WPI）封装体系。通过红外光谱和SDS-PAGE证实非共价结合，0.8%复合体系粒度达1393.67±44.15 nm，zeta电位53.28±0.68 mV，抗氧化活性分别提高28.41%和41.80%。复合体系使WPI二级结构β-折叠比例从20%增至24%，冻干后存活率96.04%，胃消化76.58%，巴氏杀菌后93.12%。证实HASH-WPI复合物的致密网络结构可作为物理屏障增强益生菌保护，体外结肠成像证实显著提升肠道粘附性，为高效稳定益生菌递送系统提供新策略。

宁 张 | 萧 卢 | 陈 敏如 | 李 新仪 | 郑 索 | 刘 飞 | 班 清峰 | 孟 星晨

中国东北农业大学食品学院，教育部乳品科学重点实验室，哈尔滨 150030

摘要

为了提高乳酸菌（Lactococcus lactis subsp. lactis KLDS 4.0325）在恶劣环境中的抗性，我们构建了一种新型的巯基化透明质酸（HA^SH）-乳清蛋白分离物（WPI）包封系统。通过傅里叶变换红外光谱和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了HA^SH-WPI复合物的形成。增加复合物中HA^SH的含量显著提高了粒径和绝对Zeta电位，分别达到1393.67 ± 44.15 nm和53.28 ± 0.68 mV，并表现出优异的抗氧化活性：对2,2-二苯基-1-吡啶肼的清除率为28.41 ± 0.51%，对2,2'-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)的清除率为41.80 ± 0.86%。此外，HA^SH含量的增加还导致WPI的二级结构从α-螺旋转变为β-折叠，后者的比例从20%增加到24%。形态分析表明，0.8%的HA^SH-WPI复合物具有均匀分散且紧密的结构，为L. lactis KLDS 4.0325提供了最佳的保护效果：冻干后存活率为96.04 ± 0.49%，胃肠道消化后存活率为76.58 ± 0.13%，巴氏杀菌后存活率为93.12 ± 0.24%。本研究证实，HA^SH-WPI复合物形成的致密网络结构可以作为物理屏障，为益生菌提供增强保护。此外，体外肠道成像直接显示该复合物显著增强了益生菌在结肠上的粘附能力。这项研究为构建高效、稳定且能保留于结肠的益生菌递送系统提供了有前景的策略。

引言

根据联合国粮食及农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）的定义，益生菌是在足够剂量下能给宿主带来健康益处的活微生物菌株（Yan, Gao, & Sun, 2025）。然而，益生菌必须能够抵抗胃酸、胆盐和酶的降解才能发挥其益处（Xu et al., 2024）。因此，开发有效的益生菌递送系统尤为重要。

微胶囊技术是实现益生菌靶向结肠递送的有效策略（Fareez et al., 2015）。大量研究表明，多糖和蛋白质不仅具有优异的生物相容性和多样性，还可以作为壁材，提高益生菌在胃肠道递送过程中的存活率（Bora et al., 2023; Ma et al., 2025）。其中，乳清蛋白分离物（WPI）因其易于消化和吸收，且成本低廉、营养价值高、具有出色的功能特性（乳化性和成膜能力）而受到广泛关注（Nie et al., 2025）。然而，单独使用WPI作为壁材在酸性胃环境中容易分解（Laurujisawat et al., 2025）。为了解决这个问题，研究表明将其与多种多糖（包括羟丙基甲基纤维素、右旋糖酐、海藻糖、β-环糊精、苦瓜多糖、结晶纳米纤维素和纳米结晶淀粉）复合是一种有效的益生菌包封和递送系统（Bora et al., 2023; Ma et al., 2025; Maleki et al., 2020; Puttarat et al., 2021）。然而，这些多糖-蛋白质复合物只能通过分子相互作用为益生菌提供物理保护，其功能性仍有待进一步提升。因此，开发具有增强功能性的新型多糖-蛋白质复合物系统已成为当前研究的关键焦点。

阴离子多糖透明质酸（HA）具有高亲水性和优异的生物降解性、无毒性和非免疫原性、非炎症性（Bokatyi et al., 2024）。其分子结构富含羧基，使其具有巯基化修饰的潜力（Bokatyi et al., 2024）。巯基化修饰是一种重要的功能化策略，可激活多糖分子中的羧基，使其与半胱氨酸的氨基形成酰胺键。巯基化聚合物可以与肠道黏液中的半胱氨酸亚结构形成二硫键（Xu et al., 2024）。Liu et al.（2020）和Luo et al.（2024）证实，巯基化的氧化魔芋葡甘露聚糖和巯基化壳聚糖能有效递送益生菌并使其粘附在肠道上。近年来，巯基化透明质酸（HA^SH）也被用于靶向益生菌递送。Li et al.（2023）以及Yang, Jike, Zhang, Jiang和Lei（2025）开发了一种基于自交联HA^SH的水凝胶递送系统，能够有效递送益生菌并提高其在胃肠道中的粘附性。然而，这种单一组分的HA^SH系统在营养功能方面存在局限性，并且二硫键自交联过程难以控制，容易受到环境因素的影响。因此，将HA^SH与高质量蛋白质（如WPI）协同整合以开发复合壁材系统具有潜力。

本研究的目的是探索这一潜力，并开发一种新型的HA^SH-WPI复合物。我们系统地评估了其理化性质和结构特征，并将其作为乳酸菌（Lactococcus lactis subsp. lactis KLDS 4.0325的有效递送系统，该菌株已被证明可以改善沙门氏菌引起的感染和肠道功能障碍（Zhang et al., 2024）。本研究将验证该复合物是否能在加工和胃肠道环境中显著提高益生菌的存活率，并进一步验证其结肠粘附特性。这可能为基于结肠黏膜粘附性的高效稳定益生菌递送系统的发展提供新的技术策略。

材料

乳清蛋白分离物（蛋白质含量94%）购自Fonterra（新西兰奥克兰）。透明质酸（纯度≥95%，CAS 9067-32-7），分子量1400–1800 kDa，购自Focusfreda Biological Co., Ltd.（中国山东）。乳酸菌（Lactococcus lactis subsp. lactis）KLDS 4.0325保存在中国哈尔滨乳品科学重点实验室的乳品工业菌种库中。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC，纯度98%，CAS

HA^SH缀合物的表征

HA^SH是通过L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的氨基与HA的羧基之间的偶联反应制备的。图1A中纯HA的FTIR光谱显示-OH伸缩振动峰位于3280 cm^?1，-COO^?的不对称和对称伸缩振动峰分别位于约1603和1410 cm^?1。相比之下，HA^SH的FTIR光谱在1560 cm^?1处显示一个新的特征吸收峰，这归因于酰胺II带的N-H弯曲振动。

结论

我们成功开发了一种基于HA^SH和WPI的新型益生菌微胶囊递送系统。我们证实，HA^SH的引入通过非共价相互作用改变了WPI的理化性质，使其粒径、绝对Zeta电位和抗氧化活性均有所提高。此外，WPI的二级结构（从α-螺旋转变为β-折叠）在与HA^SH复合后也发生了变化。

CRediT作者贡献声明

宁 张：撰写 - 原稿撰写、可视化、方法学设计、数据管理。萧 卢：方法学设计、数据管理。陈 敏如：实验研究、概念构思。李 新仪：实验研究、概念构思。郑 索：实验研究、可视化。刘 飞班 清峰：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资金获取。孟 星晨：方法学设计、项目监督。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本手稿研究的财务或个人利益冲突。

致谢

本研究得到了黑龙江省重点研发计划（JD2023SJ15）、国家自然科学基金（32072190）和国家自然科学基金青年科学基金（32502087）的资助。