《International Immunopharmacology》：miR-let-7a suppresses gastric cancer peritoneal metastasis through IRS2-mediated M1 macrophage polarization and direct inhibition of gastric cancer cells
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胃癌腹腔转移（GCPM）中mir-let-7a通过巨噬细胞M1极化抑制IRS2表达及PI3K/AKT通路，并直接抑制胃癌细胞转移，为免疫治疗提供新靶点。
熊梦媛|吴俊佳|杨红|饶航|陈忠湾|卢长川|张帆|陈健|史岩
中国人民解放军陆军医学院（第三军医大学）附属第一医院（西南医院）普通外科，中国重庆400038
摘要
胃癌是全球第五大常见且致命的恶性肿瘤，对公共卫生构成了严峻挑战，亟需采取干预措施。腹膜转移是晚期胃癌根治手术后复发和死亡的主要原因。本研究证明，miR-let-7a通过两种机制抑制胃癌的腹膜转移：首先，它通过靶向IRS2 mRNA的3'非编码区（3'UTR）促进巨噬细胞向M1表型极化，从而降低IRS2的表达和磷酸化水平，进而抑制PI3K/AKT信号通路；其次，巨噬细胞可以向胃癌细胞释放miR-let-7a，直接抑制其恶性转移能力。我们的研究结果表明，miR-let-7a和IRS2是开发胃癌免疫疗法的有希望的目标。此外，建立miR-let-7a的内源性递送系统可能为阻止胃癌进展提供创新策略。
引言
2022年，胃癌在发病率和死亡率方面位列全球第五位，新增病例约96.8万例，死亡人数约66万例[1]。尽管胃癌的死亡率很高，但其早期诊断仍然具有挑战性，中国仅有约20%的病例在早期被确诊[2]。大多数患者最初被诊断为晚期胃癌，常伴有腹膜、肝脏和远处淋巴结的转移[3]。值得注意的是，腹膜转移是胃癌患者最常见的转移和疾病复发部位之一[4,5]。根据中国国家癌症中心的数据和流行病学信息，2020年中国腹膜转移胃癌（GCPM）患者总数为52.3937万例，患病率为每百万人371例[6]。GCPM患者的预后非常差，中位生存期仅为8至13个月，长期生存几乎无望[7]。目前，GCPM患者的主要治疗方法包括加压腹腔内化疗、经导管腹腔内化疗和热腹腔内化疗[8]。虽然热腹腔内化疗结合减瘤手术可以在一定程度上延长总体生存期，但总体治疗效果仍有限[9]。近期研究进展表明，利用免疫检查点抑制剂进行联合治疗具有潜力[10]，这种方法显示出令人鼓舞的结果，如提高R0率以及延长总体生存期和无进展生存期[11]。然而，这些疗法的有效性有限，仅有约20%至30%的患者表现出积极反应[12]，这可能与肿瘤微环境的免疫抑制性质有关。因此，探索能够逆转GCPM患者肿瘤微环境免疫抑制状态的新治疗策略已成为亟待解决的问题。
随着对非编码RNA研究的深入，人们逐渐认识到单个非编码RNA可以调节多种癌症途径中多个mRNA的表达，从而发挥更复杂的调控作用。基于非编码RNA的抗癌药物开发因此显示出显著优势[13]。其中，miRNA的研究取得了重大突破。miRNA是一类由18-25个核苷酸组成的小分子非编码RNA，广泛存在于植物、动物和病毒中。它们通过结合目标基因的3'非编码区（3'UTR）来调节蛋白质表达水平，抑制目标基因蛋白质的翻译或促进其mRNA降解[14]。与mRNA类似，与癌症相关的miRNA也被分为致癌miRNA和肿瘤抑制miRNA。miR-let-7家族是一种公认的肿瘤抑制miRNA，在肺癌、结肠癌和胃癌等多种肿瘤中表达下调[15],[16],[17]。它通过靶向并抑制多种致癌因子（如RAS、HMGA2等）、多种细胞周期调控因子（如CDC25A）以及上皮-间质转化过程发挥抗癌作用[15],[18],[19],[20]。近年来，肿瘤抑制miRNA模拟物的递送系统开发成为抗癌药物发现中的有前景的方法，显示出显著的治疗潜力。例如，在KRAS驱动的非小细胞肺癌小鼠模型中，一种合成中性脂质乳液封装的miR-let-7模拟物递送系统被证明能有效减轻肿瘤负担[21]。作为let-7家族的重要成员，miR-let-7a在癌症研究领域具有重要的研究价值和应用前景。研究表明，miR-let-7a通过靶向SNAP23来抑制细胞外囊泡分泌和细胞氧化磷酸化，有效抑制结直肠癌的进展[22]。此外，miR-let-7a还在胶质瘤、黑色素瘤、胃癌等恶性肿瘤中得到广泛研究，并作为潜在的肿瘤抑制因子发挥作用[23],[24],[25]。然而，目前尚无关于其在GCPM中的作用的研究。
肿瘤免疫微环境（TME）是一个复杂的生态系统，包含胶原蛋白、血管、癌细胞、基质细胞和免疫细胞。这些成分在肿瘤生长和转移中起着关键作用[26]。其中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）作为最大的免疫细胞群体，发挥着核心作用。TAMs受到肿瘤微环境中趋化因子和细胞因子的吸引和激活[27],[28],[29]。幼稚巨噬细胞（M0）在特定信号作用下分化为M1或M2表型。M1巨噬细胞产生炎症分子以刺激T细胞并促进抗肿瘤反应[30,31]，而M2巨噬细胞分泌抗炎物质以维持免疫抑制的TME。在大多数癌症类型中，TAMs通常呈现M2表型，促进肿瘤进展[32]。特别是在GCPM患者的腹膜TME中，M2亚型的比例较高，其数量与术后患者的总体生存期相关[33]。然而，巨噬细胞的极化状态是可塑的。在TME的其他刺激下，PI3K/AKT信号通路的激活会促进巨噬细胞向M2极化[34]。这种激活导致重编程相关基因的上调，最终改变巨噬细胞的极化状态[35]。因此，靶向TAM极化已成为关键的抗癌策略。我们发现胰岛素受体底物2（IRS2）可能通过miR-let-7a调节巨噬细胞的极化。IRS2是一种胞质信号转导适配蛋白，通过上游受体（如胰岛素受体和胰岛素样生长因子-1受体）的酪氨酸激酶磷酸化招募下游效应分子[36,37]。这一过程有助于将信号从细胞外传递到细胞内。现有研究表明，IRS2在肥胖、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化等疾病中起着关键的调节作用[38,39]。IRS2可以诱导M2a巨噬细胞极化以对抗炎症[40]。此外，研究还表明IRS2参与前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤的肿瘤进展和转移[41],[42],[43]，但在GCPM中的意义尚不明确。
先前的研究表明，来自巨噬细胞的miRNA具有关键的抗肿瘤作用[44],[45],[46]。鉴于腹膜内复杂的肿瘤微环境，miR-let-7a在重塑免疫抑制微环境中的作用是本研究的重点。同时，考虑到miRNA通常被封装在递送系统（如外泌体）中以靶向肿瘤进展，我们进一步探讨了miR-let-7a是否可以从巨噬细胞传递到胃癌细胞，从而在肿瘤自主层面建立额外的抗转移途径。基于此，本研究系统地研究了miR-let-7a在GCPM中的双重调控作用。我们发现，miR-let-7a通过诱导巨噬细胞向M1极化并靶向下调IRS2蛋白表达来抑制胃癌的腹膜转移，同时巨噬细胞也可以将miR-let-7a传递到胃癌细胞，直接抑制其恶性转移能力。通过全面探讨miR-let-7a和IRS2在GCPM中的生物学意义，我们旨在发现新的治疗靶点和干预策略。
试剂
RPMI-1640和DMEM培养基购自Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.（美国，产品编号C11875500BT，C11995500BT）。青霉素/链霉素购自武汉Servicebio Technology Co., Ltd.（产品编号G4003-100 mL）。胎牛血清（FBS）购自南京BioChannel Biotechnology Co., Ltd.（中国，产品编号BC-SE-FBS07）。佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）购自Sigma-Aldrich（德国，产品编号P1585-1MG）。miRNA模拟物、抑制剂及其相应的空白载体
巨噬细胞分泌的miR-let-7a抑制胃癌细胞的迁移和侵袭
先前的研究表明，miR-let-7a在胃癌等恶性肿瘤中具有保护作用[24],[25],[26]。StarBase或ENCORI数据库的检索显示，胃癌腺癌中miR-let-7a的表达与预后呈正相关（P = 0.039）（图1A）。随后的RT-qPCR验证表明，与正常胃上皮细胞（GES-1）相比，胃癌细胞系（HGC-27和MKN-45）中miR-let-7a的表达显著下调（图1B）
讨论
胃癌由于其高发病率和死亡率，持续对公共卫生构成严峻挑战。胃癌的发病率在不同地区存在显著差异，东亚国家的发病率高于北美和西欧[1]。东亚国家（如日本和韩国）已引入了系统的胃癌筛查计划，提高了胃癌的早期发现率[48,49]。然而，由于胃癌早期症状不典型，仍有36%的病例未能在早期被诊断出来
结论
本研究证明，miR-let-7a通过两种途径抑制GCPM：在巨噬细胞中，它通过靶向IRS2 mRNA的3'UTR调节巨噬细胞极化，从而抑制IRS2的表达和磷酸化，进而抑制PI3K/AKT信号通路，促进M1极化而非M2极化，最终重塑腹膜内的免疫抑制微环境并抑制GCPM。同时，miR-let-7a可能从巨噬细胞传递到
生成式AI声明
作者声明本手稿的撰写过程中未使用任何生成式AI工具。
CRediT作者贡献声明
熊梦媛：撰写——初稿撰写、验证、实验设计、数据分析、概念构建。吴俊佳：验证、软件应用、实验设计、数据分析。杨红：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、概念构建。饶航：验证、软件应用、实验设计。陈忠湾：实验设计、数据分析。卢长川：实验设计、数据分析。张帆：验证、实验设计。陈健：撰写——审稿与编辑
伦理声明
本研究中涉及的动物实验已获得陆军医学院实验室动物福利与伦理委员会的批准，批准号为AMUWEC20252029。
资助
作者声明本研究得到了财政支持，用于文章的研究、作者身份认定和/或发表。本工作得到了重庆市自然科学基金（项目编号cstc2021jcyj-msxmX0597）和国家自然科学基金（项目编号82372807）的资助。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
