《Metabolic Engineering》：Novel routes for bioproduction of delta lactone aroma compounds.
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基因组最小化策略优化布氏杆菌作为异源宿主的生产能力，通过CRISPR-Cas12a删除p1质粒的spliceostatin合成簇使capistruin产量提升，但单独删除p2质粒导致两种聚酮-非核糖体多肽（PK-NRPs）产量下降，而双质粒删除则产量恢复。
Bruno S. Paulo|Sean B. Romanowski|Adjo E. Kadjo|Vitor B. Lourenzon|Alessandra S. Eustáquio
伊利诺伊大学芝加哥分校Retzky药学院药学科学系与生物分子科学中心，美国伊利诺伊州芝加哥
摘要
基因组最小化，包括删除编码天然产物的内源性基因簇，是提高异源产物产量的常见策略。我们一直致力于将Burkholderia sp. FERM BP-3421开发为替代细菌宿主。我们没有盲目删除基因簇（因为这可能会产生不利影响），而是根据生产培养物的转录组数据来指导我们的研究。FERM BP-3421的基因组分为两条染色体和两个质粒。转录水平最高的基因簇分别是质粒p1上的多酮非核糖体肽类spliceostatins和染色体1上的非核糖体肽类selethramide。删除spliceostatins基因簇后，核糖体肽类capistruin的产量有所提高，而删除selethramide基因簇对capistruin的产量没有影响。接下来，我们使用CRISPR-Cas12a技术针对这两个内源性质粒进行操作，使基因组大小减少了11%。经过质粒改造的菌株生长得到改善，capistruin的产量根据删除一个还是两个质粒的不同而增加了20-40%。然而，单独删除质粒p2对两种不同的多酮非核糖体肽类的异源生产产生了负面影响：p2?菌株产生的glidobactin A和megapolipeptin A的产量仅为野生型的5-23%，而在p1? p2?菌株中，产量恢复到了野生型水平。观察到p2似乎包含支持多酮非核糖体肽类生物合成的功能，这一发现为未来研究这些功能并进一步开展工程改造奠定了基础。
引言
基因组最小化不仅有助于理解基本生物学机制，还能改善异源宿主的生长性能和生产力（Kim等人，2024年）。通常被删除的基因包括移动元件、噬菌体和编码天然产物的生物合成基因簇（BGCs）（Kim等人，2024年）。研究表明，基因组缩减可以提高异源产物的产量（Komatsu等人，2010年；Morimoto等人，2008年；Vollmann等人，2025年），并且可能带来其他意想不到但有益的特性，如提高DNA转移效率和质粒稳定性（Pósfai等人，2006年）。然而，也可能出现负面现象，例如影响生长（Liu等人，2021年）。
作为基因组缩减的替代方法，有些人选择使用天然基因组已经最小化的细菌菌株（Zaburannyi等人，2014年）。不过也有观点认为，拥有更多BGCs的细菌可能更适合生产多种天然产物。例如，最近的研究指出，具有大量BGCs的细菌拥有共同进化的基因，这些基因可以促进天然产物的合成（Wang等人，2024年）。作者们（Wang等人，2024年）鉴定出不同类别的共同进化基因，并证明其中一些基因的表达可以增强不同菌株中的天然产物合成。
非模式细菌越来越多地被用作异源表达（Chan等人，2025年）或内源基因表达（Poppeliers等人，2025年）的平台。因此，基因组缩减不仅应用于模式细菌如大肠杆菌（Pósfai等人，2006年）和枯草芽孢杆菌（Morimoto等人，2008年），也用于开发替代宿主，如链霉菌（Komatsu等人，2010年）和黏细菌（Vollmann等人，2025年）。除了大肠杆菌之外，其他值得注意的假单胞菌属宿主还包括Cupriavidus necator（Calvey等人，2023年；Della Valle等人，2025年）和Pseudomonas putida（Martínez-García等人，2014年；Martínez-García和De Lorenzo，2016年）。
我们致力于将Burkholderia sp. FERM BP-3421开发为替代异源宿主，以挖掘Burkholderiales和其他β-变形菌的天然产物潜力（Heard和Eustáquio，2025年；Kunakom和Eustáquio，2019年）。从该菌株中分离出的首批天然产物是spliceostatins（如FR901464，图1A），这是一种用于抗肿瘤治疗的拼接调节剂，目前正处于抗体-药物偶联物的临床前开发阶段（Kaida等人，2007年；Nakajima等人，1996年；Puthenveetil等人，2016年）。我们选择FERM BP-3421是因为它之前已被用于工业生产，能够以g/L的产量提供spliceostatins用于这些临床前研究（Eustáquio等人，2016年）。另一种从该菌株中分离出的天然产物是selethramide（图1A），这是一种促进群体运动的脂肽（Romanowski等人，2023年）。
FERM BP-3421的基因组分为两条染色体和两个质粒，其中至少包含29个BGCs，这些BGCs分布在所有四个复制子中，编码天然产物，几乎是Burkholderia细菌平均15个BGCs的两倍（Liu和Cheng，2014年）。spliceostatins（fr9）BGC位于质粒p1上，而selethramide（sel）BGC位于染色体1上（图1B）。另外四个BGCs与已知基因具有相似性，包括编码铁载体的orb、抗生素caryoynencin、prn、抗真菌剂aminopyrrolnitrin和抗癌剂romidepsin（Istodax?）；其中只有aminopyrrolnitrin和romidepsin通过质谱法被检测到（Romanowski等人，2023年）。
在之前将FERM BP-3421开发为异源宿主的努力中，我们获得了基因组、表观基因组和代谢组数据集（Romanowski等人，2023年），通过甲基化模拟策略提高了DNA转移效率（Romanowski等人，2023年），并表征了载体（Fernandez等人，2024年）和启动子（Adaikpoh等人，2023年）。我们和其他研究人员已经使用这种宿主异源表达了核糖体合成和翻译后修饰的肽类（RiPPs）（Fernandez等人，2024年；Kunakom和Eustáquio，2020年；Merrild等人，2025年；Nguyen等人，2024年）以及多酮非核糖体肽类（PK-NRPs）（Paulo等人，2024年）。在这些研究中，FERM BP-3421的表现优于大肠杆菌及其天然生产者，突显了其作为替代宿主的实用性。
在本研究中，我们通过关注内源性BGCs来实现基因组最小化。我们没有盲目删除BGCs（因为这可能会产生不利影响），而是根据生产培养物的转录组数据来指导研究。我们认为，针对转录水平最高的BGCs进行删除将产生最大影响，同时将减少不必要的影响。由于删除质粒p1上的fr9 BGC后效果最佳，我们接下来针对内源性质粒进行操作，因为质粒通常编码非必需基因，且质粒去除后基因组大小减少了11%。然而，令人惊讶的是，删除质粒p2对PK-NRP的生产产生了负面影响。
化学试剂、酶和实验程序
PCR所需的寡核苷酸从Sigma-Aldrich购买。T4连接酶由Thermo Fisher提供。用于PCR的限制酶和Q5高保真聚合酶来自New England Biolabs。质粒DNA的提取使用ZR plasmid miniprep试剂盒（Zymo Research）完成，基因组DNA的提取则按照制造商的说明使用GenElute bacterial genomic DNA试剂盒（Sigma-Aldrich）进行。
细菌菌株
Burkholderia sp. FERM BP-3421是从国际专利组织获得的
染色体1编码selethramide，质粒1编码spliceostatins，这些是转录水平最高的BGCs
在宿主开发过程中，通过删除内源性BGCs可以创建一个“干净”的背景环境。这不仅有助于检测和分离异源产物，还能提高异源产物的产量（Komatsu等人，2010年；Liu等人，2021年；Vollmann等人，2025年）。我们之前开发了一种基于大豆蛋白胨和甘油的复杂培养基（命名为2S4G），该培养基能够实现高细胞密度和每升高的内源性产物产量
讨论
异源表达有助于加速天然产物的发现。基因组最小化是一种常见的策略，用于去除不必要的基因并提高异源产物的产量（Kim等人，2024年；Komatsu等人，2010年；Morimoto等人，2008年；Pósfai等人，2006年；Vollmann等人，2025年）。然而，哪些基因是多余的并不总是明确的，观察到的效果也可能取决于具体情境。
在基因组最小化过程中经常被删除的基因包括移动元件等
CRediT作者贡献声明
Alessandra Eustaquio：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据可视化，项目管理，方法学研究，资金获取，数据分析，概念化。Adjo E. Kadjo：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据可视化，验证，方法学研究，调查，数据分析。Vitor B. Lourenzon：方法学研究，调查，数据分析。Bruno S. Paulo：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿
未引用参考文献
Hayes, 2003; Riss et al., 2013.
数据可用性
DNA序列已存入NCBI的GenBank数据库， accession代码分别为CP196722（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p1-）、CP196719（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p2-）、CP196911（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p1- p2-）和PV932216（质粒pBS018）。RNA序列的存入代码为PRJNA1358255。
利益冲突声明
我们没有需要声明的利益冲突。
致谢
我们感谢日本国立技术评估研究所的国际专利机构提供FERM BP-3421菌株；感谢威斯康星大学麦迪逊分校的Brian F. Pfleger提供glidobactin A标准品；感谢法国巴黎国家自然历史博物馆的Séverine Zirah提供capistruin标准品；感谢西蒙弗雷泽大学的Michael Recchia和Roger Linignton提供megapolipeptin A标准品；以及感谢伊利诺伊大学芝加哥分校的Galen Ptacek提供p2 GO术语分析。
