《Frontiers in Marine Science》：Assessing benthic community structure and diversity in the Western Pacific polymetallic nodule area: insights from multi-primer eDNA metabarcoding
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本文综述了应用多基因环境DNA（eDNA）宏条形码技术评估西太平洋多金属结核区底栖生物（包括原核生物16S rRNA和真核生物18S rRNA、COI）群落结构与多样性的研究。文章揭示了不同引物（如V1V2、V9、COI）对特定类群（如有孔虫、甲壳动物、缓步类）的检测偏好性，以及细菌和真核生物α多样性随沉积物深度（0–5 cm vs. 5–10 cm）增加而显著降低的趋势（古菌群落无此趋势）。研究证实eDNA技术可克服传统形态学方法的局限，为深海采矿前的生物基线评估提供高效、科学的监测手段。
引言
深海（深度大于200米）占地球表面的60%，是全球最大的海洋生物量和生物多样性储库。在大于碳酸盐补偿深度（CCD）的深海平原，斑块状分布着富含锰、铁以及其他经济元素（如铜、镍、钴）的多金属结核。这些结核通常覆盖在海床表面或嵌入底层沉积物的上部5-10厘米层。为应对日益增长的金属需求，多金属结核的商业开采可能即将开始。
深海采矿作业预计将扰乱底栖生态系统，特别是沉积物性质和深海动物区系。例如，大多数小型底栖生物（生活在沉积物中或表面、能通过1毫米筛但被40微米筛保留的后生动物）栖息在沉积物顶部0-10厘米，其中大部分生物量集中在0-5厘米层。深海细菌和古菌代表了深海海底最大的生物量存量。这些底栖微生物不仅驱动能量流动和生物地球化学循环，还构成了直接支持较低营养级（如小型底栖动物）的营养基础。它们在采矿过程中将不可避免地受到干扰。
研究重点一直集中在多金属结核合同区底栖群落的丰度、生物量、多样性和群落组成上，这涉及从基质中采集标本或通过视觉数据进行分类，以及进行形态学鉴定。近年来，随着分子技术的发展，环境DNA（eDNA）在生物多样性和群落结构研究中发挥着越来越重要的作用，并具有明显优势。与基于形态学的方法相比，eDNA宏条形码在速度、样本成本、覆盖范围以及独立于分类学专业知识方面具有优势。先前在深海多金属结核合同区的eDNA采样表明，沉积物中的分类记录表现出高度的局部异质性，真核生物群落中未表征物种的比例很高。尽管关于多金属结核富集区域深海沉积物中微生物群落的信息有限，但越来越多的共识认为，多金属结核、周围沉积物及上覆水柱构成了不同的微生物栖息地，每个栖息地都拥有特征性的组合。研究表明，沉积物中细菌群落的多样性高于结核中的多样性，并且在远距离地点，微生物群落在门水平上保持高度相似。尽管古菌仅占原核生物的19%-36%，但它们在碳、氮和金属生物地球化学循环中发挥着关键作用。有孔虫和线虫是主要的真核生物类群。线虫占小型底栖动物丰度的90%，而小型底栖动物占2000米深海洋生物多样性的80%。
为了进一步澄清用于评估深海采矿造成损害的生物多样性基线，本研究尝试对西北太平洋北京先驱高技术开发公司（BPC）M2区块五个结核站点的箱式岩心沉积物样本使用eDNA技术。比较了不同引物、地点和沉积物深度下底栖群落的分类组成和多样性。本研究旨在检验以下假设：（1）使用多个遗传标记表征多金属结核区域沉积物中原核和真核生物群落的结构；（2）比较不同沉积物深度生物群落组成的变化，以识别每个层位的主导物种；（3）通过比较沉积物eDNA检测到的生物多样性清单与传统采样方法生成的物种分类记录，对eDNA技术进行客观评估。本研究对于表征自然深海环境条件下底栖生物群落的结构（组成、多样性、密度和分布）具有重要意义，可为后期评估采矿对底栖生物的影响提供参考经验。
材料与方法
采样
于2023年8月至11月期间，在西北太平洋海洋一号船DY81航次中，使用箱式取样器在北京先驱高技术开发公司（BPC）的M2区块采集了沉积物样本。采样区域范围为东经153°至155°，北纬18°至19°。结核丰度范围为0至52.8 kg/m2，平均值为26.16 kg/m2，标准差为11.11 kg/m2。使用直径7厘米的推管从箱式岩心中取顶部0-10厘米的沉积物样本，在舷廊上将同一多管取样器中的沉积物无菌地分为两层（0-5厘米和5-10厘米），样本带回船上后于-80°C冷冻保存，直至后续DNA提取。
DNA提取、PCR扩增和高通量测序
使用Soil FastDNA SPIN试剂盒按照制造商说明提取沉积物DNA。为从有限的深海底栖样本中提高DNA产量，每个样本同时进行三次重复提取。随后，使用60 μL洗脱缓冲液从重复样本中洗脱总DNA。使用NanoDrop分光光度计评估提取DNA的浓度和纯度。同时，设置提取空白（阴性对照）以评估提取过程中的潜在污染。对于细菌分析，使用引物338F和806R扩增16S rRNA基因的V3-V4区域。对于古菌群落，使用引物524F-10-extF和Arch958-modR扩增16S rRNA基因的V5-V6区域。对于真核生物多样性评估，使用了多对引物：针对18S rDNA V9区域的引物对1380F和1510R；针对18S rDNA V1-V2区域的引物对SSU_FO4和SSU_R22；以及针对线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）基因的引物对LCO1490和HC02198。随后，在上海美吉生物工程有限公司的Illumina MiSeq PE250平台上进行双末端测序。基于独特的条形码对将双末端原始读数解复用为单个样本。使用DADA2流程从解复用的读数中推断扩增子序列变体（ASVs）。质量过滤和去噪的关键参数设置如下：maxEE = 2, truncLen = 0, trimLeft = 0, minLen = 0, maxN = 0, truncQ = 0。此配置禁用了固定长度修剪，从而保留了完整的读长信息，并通过maxEE参数确保了严格的质量控制。
宏条形码数据分析、质量控制和数据处理
从Illumina HiSeq测序平台获得的原始双末端读数使用数据处理流程进行分析，主要包括以下步骤：1）使用DADA2流程处理从Illumina测序获得的高质量双末端读数，以推断ASVs。2）使用基因特异性方案和数据库进行ASVs的分类分配。对于18S rRNA和COI基因扩增子，通过针对NCBI非冗余核苷酸数据库执行BLAST最佳命中搜索进行 taxonomic annotation，最小置信度阈值为80%。对于16S rRNA基因扩增子（V3-V4区域），使用classify-sklearn特征分类器针对SILVA 138数据库对ASVs进行分类，置信度阈值为70%。为最小化非底栖生物DNA信号的干扰，对所有真核生物引物衍生数据（18S V1V2, V9, COI）应用了统一的生物信息学过滤步骤。具体而言，排除了属于以下门类的序列：Bacillariophyta, Chlorophyta, Haptophyta, Rhodophyta, Oomycota, Prasinodermophyta, 和 Streptophyta。这些微藻和巨藻类群在无光的深海沉积物中的存在主要归因于上覆水柱的沉降，并不代表该栖息地中的活跃底栖组分。为最小化测序工作量带来的偏差，将数据集稀释到最小样本的大小。使用mothur估计稀释曲线以评估测序工作量。
基于丰度数据，使用Bray–Curtis指数对不同垂直分层样本之间群落特征的变化进行层次聚类分析。对于α多样性指数的差异检验，首先使用Shapiro–Wilk检验检查数据的正态性，并使用Levene检验进行方差齐性检验。如果数据符合正态分布且方差齐，则使用独立样本t检验；否则，使用Mann–Whitney U检验。结果通过Bonferroni多重比较进行校正。通过计算过滤后的生物类群的相对丰度并对所有样本中的每个分类单元（行）应用Z-score标准化来生成热图。所有统计分析均在R v3.3.2中进行。原始读数已提交至NCBI序列读段存档（SRA）数据库（BioProject ID: PRJNA1358054 和 PRJNA1367323）。
结果
测序数据和分类分配概述
基于eDNA数据，图2显示了使用不同引物获得的读数和ASVs数量。经过质量控制后，18S rRNA和COI的读长计数分别减少了54%和40%。每个样本平均保留20,040条（18S）和43,572条（COI）高质量读数。随后从数据集中移除了在界水平未识别或分配给细菌、古菌、原生生物和后生动物的ASVs。稀释曲线表明所有样本均经过充分测序，足以捕获样本内扩增子的总丰富度。BC26_5_10样本中基于16S rRNA V3V4引物的数据不可用。基于从BC20_5_10样本提取的DNA，基于18S rRNA（V1V2和V9引物）的扩增均不合格。经过V9引物的序列去冗余后，BC26_5_10样本的数据可用性也很低。COI引物未在BC26站点的两个深度检测到信号。上述未能反映采样点不同深度群落变化趋势的结果被排除在后续分析之外。
基于物种丰度值的聚类热图显示，0-5厘米样本在热图中形成一个独立的簇，包含高丰度类群（纤毛虫、顶复门）。5-10厘米样本则单独聚类，主要与低氧耐受类群（如有孔虫、动质体）相关。此外，不同引物检测到的类群在热图中清晰聚类。基于两种18S rRNA引物（V1V2和V9），在不同深度层检测到了Spirotrichea, Ascetosporea, 和 Conoidasida（检测样本数 > 6），而Perkinsozoa和Phyllopharyngea几乎仅存在于表层。COI引物的覆盖范围较窄，仅检测到三个类群：Elardia, Flabellinia, 和 Discosea。有孔虫在0-5厘米层的BC20_0_5样本中占比最高（37.29%），其丰度在更深的5-10厘米层（BC08_5_10: 23.89%）有所下降。然而，有孔虫在0-5厘米和5-10厘米深度仍然是绝对优势类群。锥虫纲在5-10厘米层的BC14_5_10样本中比例相对较高（57.10%），可能是一个深层特异性类群。纤毛门在0-5厘米层的BC14样本中占32.42%，但在更深层完全消失。尾丝虫纲是V9引物特有的生物类群，其在0-5厘米层的比例（30.03%-50.9%）高于5-10厘米层（4.38%-27.8%）。对于Xenacoelomorpha，其在上层的比例变化很大（0.17%-35.10%），在5-10厘米层的BC08样本中达到最大值45.95%；然而，在其他四个深层站点未检测到。在科水平，V1V2引物显示出最广泛的分类覆盖范围，不仅检测到多个高丰度类群（例如Hyalospheniidae），还检测到一系列被其他引物遗漏的独特类群（例如Cephaloidophoridae, Convolutidae）。相比之下，V9引物显示出对特定类群的强烈偏向。尾丝虫纲在V9数据集中成为绝对优势类群，这种模式在V1V2或COI引物中均未观察到。相反，COI引物在原生生物检测方面表现明显较差，仅识别出少量科级类群。这应归因于COI标记对原生生物的技术局限性，而非这些类群的实际缺失。
后生动物群落基于不同引物的解读
多金属结核区由18S rRNA和COI引物扩增的优势后生动物门类集中在节肢动物门、刺胞动物门和脊索动物门。V1V2引物特有的门类有棘皮动物门和栉水母动物门。在0-5厘米层，三种引物在纲水平的最大检测能力分别为22个（V1V2）、13个（V9）和3个（COI）分类群。在5-10厘米层，生物类群数量显著减少，与上层的物种重叠度低。聚类热图表明，0-5厘米层的样本（BC17, BC08, BC14）形成一个独立的簇，与5-10厘米层的样本（例如BC26, BC20）分开。V1V2引物覆盖了27个分类群，覆盖范围最广。六幼节纲和线虫纲作为底栖后生动物的优势类群，被两种18S rRNA引物共同扩增。V1V2特有的类群包括鳃足纲、Enopla、多板纲、海樽纲、触手冠动物、Rhabditophora、介形纲、蛇尾纲和尾索动物纲。与18S rRNA基因相比，本研究中的COI基因仅在0-5厘米层扩增出来自六个门的后生动物类群。在科水平，V1V2和V9引物共同揭示了后生动物群落的复杂性，但侧重点不同。它们都检测到了典型陆生真核生物（如猫科、人科）的DNA污染，这反映了eDNA技术的高灵敏度，也表明了在数据分析中设置严格过滤标准的重要性。同时，它们也检测到了真实的海洋底栖类群，如Campanulariidae（水螅目）和线虫纲。COI引物的覆盖范围仍然明显窄于V1V2和V9。对于线虫纲等优势底栖类群，COI未能有效检测。
讨论
使用分子方法评估多金属结核合同区的生物多样性
多标记宏条形码技术越来越受欢迎，以改进基于单一分子标记的海洋物种多样性评估。我们采用了经过验证的引物（16S, 18S, COI），靶向微生物和广泛的真核生物多样性。利用eDNA宏条形码技术研究了西太平洋多金属结核合同区底栖群落的整体组成和分布，旨在尽可能捕获深海群落的生物多样性。基于结果，变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门是结核合同区沉积物中的优势细菌类群，这与CCZ的报告相似。
与同一区域2024年环境影响评估报告中的底栖后生动物名录进行比较，揭示了显著不同的分类谱。在门水平，eDNA宏条形码显示出更广的覆盖范围，检测到13个后生动物门，而传统形态学仅识别出9个门。优势门也不同：eDNA数据中最普遍的是刺胞动物门和节肢动物门，而形态学记录中主导的是线虫纲和节肢动物门。这种互补关系在更精细的分类分辨率上变得更加明显。在科水平，两种方法的识别能力相对接近（分别为54.5%和45.9%）。然而，随着分辨率提高到属和种水平，两种方法之间的重叠显著减少。因此，两种方法共享的分类单元仅占每种方法捕获的总多样性的很小一部分。传统形态学方法对特定大型底栖动物类群具有更高的分辨率，识别出许多独特的属，而eDNA也成功扩增了传统方法未检测到的类群。这种明显的差异强调了它们强大的互补性，观察到的差异可归因于几个因素：（1）采样策略导致的地理隔离和时间差异；（2）与DNA降解相关的风险，导致一些低丰度物种扩增无效；（3）序列聚类可能被错误地扩增到同一属。另一个重要的限制是缺乏全面且组织良好的用于分类的参考遗传数据库。如本研究所示，使用eDNA技术已识别出属于30个门的208种真核动物（17种属于原生生物，13种属于真核生物）。也就是说，通过eDNA宏条形码调查可以回收广泛的真核生物分类单元，尤其是原生生物群落。本研究中使用COI引物仅扩增出来自六个门的后生动物类群。COI基因参考数据库质量差可能是造成这种情况的另一个原因。
总之，eDNA技术的应用根据所研究的生态系统和研究目标会产生不同的结果。因此，未来的研究应采用量身定制的技术组合——选择合适的遗传标记，并在可行的情况下整合形态学方法——以构建对深海生物多样性更全面的理解。
不同生物类群在深海沉积物中的群落分布模式
在深海中，物种的分布与深度密切相关，从微生物到巨型底栖动物都局限于特定的深度。
微生物作为海底生态系统的主导者，具有高度稳定的群落结构。古菌和细菌通过氮、碳和硫/金属循环形成紧密的代谢相互作用网络，共同维持深海多金属结核合同区的化能营养流。例如，SAR202_clade在所有站点不同层内均表现出高丰度，可能参与复杂有机物（如几丁质、纤维素）的降解。Woeseia作为一种海洋沉积物中的化学异养细菌，与硫循环或碳代谢有关。其丰度在各站点稳定，没有明显的垂直差异。古菌类群Nitrosopumilaceae在所有站点（0-5厘米和5-10厘米）都具有极高的丰度。该类群通过氨氧化反应产生亚硝酸盐（NO2?）和质子（H+），可能间接促进锰（Mn2+）和铁（Fe2+）的氧化，形成结核中的锰氧化物（如Mn4+）和铁氧化物，共同驱动金属氧化-矿物沉积。我们研究的一个关键发现是对沉积物深度的对比反应：与变化的细菌和真核生物群落不同，古菌的组成和功能潜力（如硝化作用）从表层到深层保持稳定。
深海多金属结核区的真核生物群落显示出显著的垂直分化：0-5厘米表层中高丰度的有孔虫（需氧型）和变形虫类群反映了深海表层的富氧环境。表层沉积物是大多数生物类群的主要活动区域，由于环境压力，丰度随深度增加而降低。例如，Actinopteri, Scyphozoa, 和 Demospongiae 仅在第0-5厘米层检测到，这与它们的生活习性以及留在表层的DNA信号有关。六幼节纲是所有站点不同深度的优势类群，但其在深层的丰度下降。Anthozoa, Catenulida, Chromadorea, Enopla（线虫）, Hydrozoa, 和 Polychaeta的丰度在5-10厘米层下降，因为它们的幼虫分布受沉积物粒径和有机物含量影响。这种由环境因素引起的生物丰度随深度的变化在热液喷口附近的沉积物中也显示出相同的趋势。除了深度，深海底栖群落的组成还受到各种环境因素的影响，如食物供应、溶解氧、底流、沉积物类型和有机物。5-10厘米层中鳃足纲的丰度也反映了底层DNA的另一个可能来源。底栖生物（如多毛类和许多活动生物）可能将休眠卵从表层携带到 subsurface sediments。
使用eDNA宏条形码评估深海生物多样性
与COI数据集相比，18S数据集 consistently yields more ASVs that can be successfully taxonomically assigned，并且18S获得的分配率和检测率均高于COI。这一发现与在近岸或水层生态系统中进行的研究形成对比，后者报道了COI标记的优越性能。Giebner等人（2020）直接比较了COI和18S方法；他们的样本包含了相当比例的陆生节肢动物——这是一个COI标记特别适合的后生动物类群。相比之下，深海沉积物代表了一个以高度降解DNA为特征的环境。研究表明，在此类栖息地中，多拷贝的18S rRNA基因比单拷贝的蛋白质编码COI基因表现出更高的检测率和更强的技术稳定性。此外，深海沉积物真核生物群落主要由原生生物（例如有孔虫、纤毛虫和尾丝虫）组成，对于这些类群，通用COI引物和参考数据库的覆盖范围远低于18S标记。Mazurkiewicz等人（2024）关于北极峡湾的研究为理解不同栖息地eDNA性能提供了关键视角。它表明，基于形态学的方法在揭示大型底栖动物对冰川干扰的强烈响应方面更有效，而eDNA（特别是使用18S标记）对于检测小型底栖动物和有孔虫群落的逐渐变化是不可或缺的。V1V2扩增的高丰度原生生物类群，如有孔虫、鞭毛虫、阿米巴、纤毛虫和动质体，与先前关于深海沉积物原生生物的研究基本一致，表明特定引物如V1V2的偏好性可以更全面地覆盖原生生物内的复杂类群，进一步验证了其在极端环境生物监测中的可靠性和灵敏度。
跨站点一致检测到的垂直分层表明，完整的海底支持着一个结构化的、多样化的生物圈。需要进一步研究以确定此处识别出的优势类群在更广阔的太平洋结核省是否表现出区域一致性，或随环境梯度变化。因此，未来的工作应优先整合eDNA与形态学调查，以验证分类分配并提高生物监测的准确性。最后，需要进行更多的实验研究来评估这些群落在面临潜在采矿影响时的恢复力和功能稳定性。
结论
我们提供了明确的证据，表明深海多金属结核区在不同沉积层和引物靶点中拥有独特的生物群落。不同引物检测到的类群重叠度低，表明全面的底栖群落结构和多样性评估需要多标记方法。重要的是，跨站点一致检测到的垂直分层表明，完整的海底环境维持着一个结构化和多样化的生物圈，为评估未来的环境扰动提供了关键基线。
