《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Engineering human bone marrow-derived mesenchymal stromal cell aggregates for enhanced extracellular vesicle secretion in a vertical-wheel bioreactor
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本研究创新性地采用垂直轮式生物反应器（VWBR）培养三维（3D）人骨髓间充质基质细胞（hMSC）聚集体，通过剪切应力调控显著提升了细胞外囊泡（EV）的产量（提升3-10倍）并富集了具有神经再生潜能的微小RNA（miRNA） cargo（如miR-29a-3p、miR-133a-3p）。该研究为规模化生产治疗性hMSC-EVs提供了关键技术平台，对神经病变修复具有重要转化意义。
研究背景
人骨髓间充质基质细胞（hMSC）因其抗炎和促血管生成的分泌组在再生医学中展现出巨大潜力。细胞游离疗法利用hMSC来源的细胞外囊泡（EV）作为治疗剂已成为一种有前景的策略。EV是几乎所有细胞类型分泌的球形脂质双分子层颗粒，在细胞间通讯、组织稳态和病理生理过程中发挥关键作用。这些囊泡，特别是平均直径约30至200纳米的小尺寸EV亚群，含有反映其细胞来源的治疗性 cargo，包括生长因子、脂质、蛋白质和核酸。这些生物活性分子的靶向递送促进了疾病调节，为传统治疗方法提供了替代方案。
然而，hMSC-EVs的临床转化仍受限于低生产产量。传统的二维（2D）培养产生的EV产量低，且细胞传代之间存在批次间差异。此外，2D培养无法复制天然的细胞外基质（ECM）环境，限制了细胞与细胞以及细胞与基质的相互作用。相比之下，三维（3D）培养使细胞能够形成更准确模拟体内环境的聚集体，从而增强EV产量。最近的研究强调了将hMSC作为3D聚集体培养的优势——这些是由大约500至10,000个细胞组成的致密球体，具有缺氧核心，与传统的贴壁单层培养相比，能更好地模拟体内微环境。在这种3D形式下，hMSCs表现出增强的细胞-基质相互作用、信号转导、旁分泌信号传导和治疗效果。
材料与方法
本研究使用骨髓来源的hMSC（BM-hMSCs），在垂直轮式生物反应器（VWBR）中作为3D聚集体进行培养。研究采用了两种不同的培养基：含血清的αMEM/FBS和无血清的DMEM/F12/B27，并在三种搅拌速度（25、40和64 rpm）下进行。通过代谢物分析和qRT-PCR评估代谢活性和EV生物发生，重点关注ESCRT机制标记物。分离EV并评估其产量、大小、标记物和微小RNA cargo。进行功能测定以测量EVs在LPS诱导的神经炎症下对施万细胞（Schwann cells）的影响。
结果
BM-hMSC在VWBRs中的聚集
在αMEM/FBS条件下，所有VWBR条件均形成了hMSC聚集体，且比ULA静态对照的聚集体尺寸更均匀。在较高的搅拌速度下，hBM-MSCs形成大聚集体的能力降低，表明增加的湍流影响了聚集体的形态和大小。对生物反应器的每日取样显示，所有条件下每毫升培养基的细胞数量逐渐下降。在接种时，所有条件的初始接种密度为2.0 × 104个细胞/毫升。细胞数量在整个实验过程中每天稳定下降约0.5倍，而存活率始终保持在高水平，αMEM培养物在接种后初始测量后介于97%–99%之间，DMEM培养物介于80%–84%之间。培养环境的pH值在7.4和7.5之间波动，条件之间未观察到显著差异。在DMEM/F12/B27条件下，VWBR条件产生了均匀且小的hMSC聚集体，与ULA静态对照相比。细胞数量、pH值和存活率显示出与αMEM/FBS条件相似的趋势。
BM-hMSC聚集体代谢和EV生物发生的分析
代谢物数据揭示了与静态对照相比，VWBR条件下培养物具有不同的代谢适应。在αMEM/FBS培养物中，乳酸水平逐渐增加，尤其在64 rpm时。ULA组在第3天显示出比VWBR条件更高的乳酸浓度。葡萄糖消耗在所有条件下保持稳定，支持持续的代谢活动，与搅拌速度无关。乳酸产量与葡萄糖消耗的摩尔比（理论范围为1.0–2.0）约为2.7，这可能受到总体葡萄糖利用率低的影响，与增强的无氧代谢一致。对于谷氨酰胺代谢，浓度在所有条件下从1.0 mM下降至约0.8 mM。氨水平增加而谷氨酸轻微上升，产生的氨/谷氨酰胺摩尔比约为1.0–1.2。离子浓度在ULA培养物中显著高于VWBRs，包括钠（约170 mM vs. 150 mM）、钾（约7.0 mM vs. 6.0 mM）和钙（约1.8 mM vs. 1.5 mM）。
在具有高基线葡萄糖浓度的DMEM/F12/B27培养物中，无法检测到显著的葡萄糖消耗；因此无法计算乳酸产量/葡萄糖消耗比率。除40 rpm处有一个明显的异常值外，乳酸产量保持一致。由于使用了Glutamax，无法测量谷氨酰胺水平。尽管在所有条件下都观察到氨积累。ULA和VWBR组之间的离子浓度相似，钠约为160 mM，钾约为5.5 mM，钙约为1.0 mM。代谢趋势的差异可能反映了DMEM/F12/B27与补充了FBS营养的αMEM配方相比，含有更多的维生素和氨基酸。基于代谢物数据和培养形态，DMEM/F12/B27条件不支持像αMEM/FBS条件那样稳健的hMSC聚集体形成。随后的实验集中在αMEM/FBS条件上。
qRT-PCR数据显示，在αMEM/FBS中于64 rpm下培养的BM-hMSCs表现出最高的EV生物发生基因表达，与静态对照（ULA 6孔板）和40 rpm条件相比。25 rpm条件未获得足够的mRNA用于分析。在ESCRT非依赖性基因中，与ULA相比，动态VWBR条件（64 rpm）下，SMPD2、SMPD3、RAB27a和RAB27b均显著上调（约1.5–2.5倍）。与40 rpm相比，SMPD3表达在64 rpm时升高，而RAB27a和RAB27b在两种动态条件下均显著上调。分析的ESCRT依赖性基因包括STAM1、ALIX、TSG101和HRS，这些对于内体出芽、选择性cargo分选和导致EV释放的多囊体（MVB）形成至关重要。与ULA相比，动态VWBR培养物中STAM1、TSG101和HRS显著上调（约1.3-2倍），其中TSG101在64 rpm时显示出额外增加。ALIX表达与ULA对照相比未显示统计学显著变化。总体而言，对于αMEM/FBS条件，VWBR促进了8个EV生物发生基因中的7个。对于DMEM/F12/B27条件，VWBR促进了8个EV生物发生基因中的4个，包括Rab27a、SMPD2、SMPD3和STAM1，特别是在40 rpm时。
代谢基因表达显示微小变化。PDK1和己糖激酶-2（HK2）在不同条件之间无统计学差异，而LDHA和PKM2在ULA中略高于40 rpm VWBR。相比之下，磷酸戊糖途径（PPP）的关键酶6PGD和G6PD在64 rpm时与ULA静态条件相比显著上调。在较高搅拌条件下观察到的PPP相关基因表达增加反映了用于ATP生成的糖酵解通量增强和用于NADPH产生的PPP激活，表明向氧化还原调节和代谢适应的转变。
分泌EV的大小、产量、形态和EV标记物分析
从用过的培养基中分离出EV，并通过NTA表征EV大小和产量。在αMEM/FBS中，EV产量随着搅拌速度的增加而显著增加，从ULA对照的2 × 102个EV/细胞增加到64 rpm时的1.5-2.5 × 103个EV/细胞，代表了约10倍的增加。这些发现表明动态培养促进了EV释放。相比之下，在DMEM/F12/B27内，EV分泌随着搅拌显示出适度的增加，64 rpm条件达到显著性（从3 × 103到4.5 × 103个EV/细胞）。此外，平均EV大小在所有培养条件下一致，范围在30–200纳米。αMEM/FBS条件的EV大小为140–160纳米。对于DMEM/F12/B27条件，EV大小在VWBR条件下略微增加（140纳米–150–160纳米）。这些结果表明，VWBRs中的机械刺激不会改变EV大小或膜完整性，但会增加EV产量，与我们团队之前的发现一致。
TEM成像验证了EV的完整凹形形态，增强了差速离心分离过程的可靠性。Western blot分析确认了阳性EV标记物CD63和HRS的存在。相反，Calnexin（阴性EV标记物）信号的缺失确认了低细胞污染。培养基组成和机械搅拌的结合反映了其对细胞代谢和最终EV分泌的影响。
分泌EV中miRNA cargo的分析
对3D BM-hMSCs的EV进行了miRNA cargo分析，并与2D细胞的EV进行了三重比较，使用下一代miRNA测序。主成分分析（PCA）揭示了两组之间的清晰分离，PC1（23.5%）解释了大部分方差，表明培养维度强烈影响EV miRNA组成。热图进一步突出了2D和3D hMSC来源EV之间不同的基因表达谱。值得注意的是，2D和3D培养EV中差异miRNA表达水平表明了代谢和信号环境的基本差异。
火山图进一步说明了3D与2D培养EV之间差异基因表达，其中3D hMSC EV中显著上调的差异表达基因（DEGs）（17个）以红色突出显示，2D hMSC EV中显著下调的DEGs（13个）以蓝色显示，非显著DEGs（347个）以灰色显示。小提琴图提供了特定miRNA表达变化的详细可视化，重点关注了来自两种培养条件的EV中的hsa-miR-133a-3p和hsa-miR-1291。hsa-miR-133a-3p在2D hMSC EV中显著上调，与通过激活PKM2酶调节有氧代谢密切相关。相比之下，hsa-miR-1291在3D hMSC EV中上调，可能反映了支持hMSC聚集体中非增殖状态维持的代谢转变。
最后，京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析突出了受特定miRNA数据影响最显著的生物学通路（3D/2D），通过蓝色强度识别。详细的KEGG富集表总结了顶级通路 - 包括术语基因、靶基因、相关miRNA、P值和错误发现率值。KEGG分析确定了与EV生物发生、代谢和神经调节相关的信号通路。特定的miRNA，如hsa-miR-29a-3p、hsa-21-5p、hsa-133a-3p，被确定为在Janus激酶信号转导和转录激活因子（Jak STAT）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、ECM受体相互作用、血管内皮生长因子（VEGF）、钙、肌动蛋白细胞骨架和轴突导向信号通路中信号转导方面最具影响力。
EV在施万细胞体外炎症功能测定中的评估
为了评估来自每个实验条件的3D BM-hMSC来源EV的治疗潜力，用LPS预处理hSCs 8小时以激活NF-kB信号。免疫染色确认了p65亚基的核转位，表明促炎基因激活。诱导炎症后，以每细胞1,000个EV的剂量处理SCs 24小时。该剂量是基于先前的研究和临床前动物给药指南中每次剂量每公斤体重的EV蛋白质选择的。处理后，收获SCs，提取总mRNA并通过qRT-PCR分析以评估促炎和抗炎基因表达的变化。所有实验组均包含在分析中，除了αMEM培养基组中的ULA条件，该条件产生的mRNA不足以进行表征。
在所有实验条件下，抗炎基因的表达，包括脑源性神经营养因子（BDNF）（5-10倍）、CD163（3-10倍）和ARG1（2-5倍）通常比未处理的LPS-only对照升高。BDNF表达在大多数条件下显著增加，其中αMEM 25显示出最高表达水平。CD163表达在来自αMEM 25、αMEM 64和DMEM ULA的EV中显著上调，而ARG1仅在DMEM 25和DMEM ULA条件下显著。TGFβ基因表达在所有条件下显示最小变化。
促炎基因IL-6和TNF-α显示出可变反应。与LPS-only对照相比，IL-6和TNF-α在αMEM 25中降低，而其他条件显示不一致的变化。鉴于变异性，无法建立TNF-α跨剪切应力条件的清晰趋势。有趣的是，用BM-MSC来源的EV处理LPS刺激的SCs导致在几个实验条件下抗炎基因和促炎基因均上调。这些结果突出了EV cargo对LPS诱导炎症的潜在短期调节作用，这值得在长期研究中进一步研究。
Hsa-miR-21-5p已被证明在脊髓损伤中具有神经保护作用，通过减少神经炎症和通过调节程序性细胞死亡蛋白4（PDCD4）促进神经突生长。如图6Aii所示，miR-21-5p水平在3D培养条件下高于2D。为了评估通过EV递送的miRNA cargo的治疗潜力，进行了RNase保护测定以评估封装在BM-hMSC来源EV内的miRNA的稳定性。RNase消化后，进行靶向miR-21的qRT-PCR，并比较不同组的循环阈值（Ct）值，其中较低的Ct值对应于较高水平的可检测miR-21。仅miR-21组（有或没有RNase处理）（第3组和第4组）支持了去除游离或未结合的小RNA寡核苷酸的有效性。将装载了合成的miR-21寡核苷酸的hMSC-EVs（第2组）与hMSC-EV组进行比较，装载EV中的miR-21水平比hMSC EVs的原始水平高约28000倍。为了比较，未与miR-21混合的hMSC-EVs也进行了电穿孔，并且这两组用RNase A孵育以去除游离的miR-21寡核苷酸。结果表明，电穿孔方案可以成功地将miRNA寡核苷酸引入EVs。RNase A消化后，miR-21信号的持续存在表明寡核苷酸主要在EVs内部受到保护，而不是外部自由结合。总之，这些结果突出了EVs稳定递送功能性miRNA的能力，强调了它们作为神经炎症细胞游离治疗的潜力。
讨论
VWBR培养系统对hMSC聚集的影响
虽然hMSC的聚集体培养通过比2D培养更好地模拟天然组织环境提供了优势，但它也与降低的增殖率相关。3D培养环境增强了治疗性、免疫抑制和抗炎因子的表达，但同时通过细胞周期停滞限制了hMSC增殖。与hMSC 2D培养不同，hMSC聚集经历影响细胞表型的独特代谢过程。
在这项研究中，总细胞数量逐渐下降，这可归因于剪切应力对聚集体形成的影响。成功整合到聚集体中的细胞通过细胞间粘附受到保护，并表现出具有减少增殖的凝聚行为，而被排除在聚集体之外的细胞则丢失。因此，发生了两个平行过程：（i）聚集体内的细胞经历凝聚行为和细胞周期停滞，作为一种生存和保存策略，而（ii）脱落或被排除的细胞无法存活，导致细胞数量下降。这反映了从增殖向紧凑、代谢活跃状态的转变，细胞保持高存活率并浓缩细胞物质。
聚集动力学研究为这些过程提供了额外的见解。Tsai等人证明，动态悬浮液中hMSC的聚集取决于碰撞、粘附和肌动蛋白-肌球蛋白介导的压缩的顺序事件，所有这些都由流体动力学条件塑造。剪切应力和细胞粘附分子如钙粘蛋白和胶原蛋白在聚集体形成中扮演不同角色。钙粘蛋白对于加强早期细胞间接触至关重要，而胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白调节较小簇形成较大球体的形成。重要的是，较高的剪切应力限制了稳定粘附的机会，导致更小和更均匀的聚集体，而抑制钙粘蛋白介导的粘附则完全破坏了聚集体生长。这些发现支持了我们的解释，即在剪切应力下无法建立稳定粘附相互作用的细胞被脱落进入培养基并最终丢失，可能通过失巢凋亡。
对细胞代谢和EV生物发生的影响
我们的研究假设3D聚集体中的糖酵解转变反映了氧扩散和保持干性的要求，因为糖酵解允许hMSCs在缺氧压力下维持存活，同时减少细胞对氧化磷酸化的依赖。此外，糖酵解相关的miRNA（miR-133a-3p、miR-143-3p和miR144-3p）可能通过调节通路如PI3K-Akt和mTOR进一步强化这种代谢适应，最终将能量代谢与增强的EV生物发生联系起来。
hMSC聚集体经历向糖酵解的代谢转变，通过线粒体呼吸，这是由氧梯度驱动的，以维持hMSC干性、存活和增殖。在培养环境中，3D球体的内部细胞由于营养物扩散而经历缺氧微环境。hMSC聚集体表现出增加的活性氧（ROS）产生和减少的细胞内乳酸产生。此外，作为有氧糖酵解证据的糖酵解基因表达，如G6PDH、LDHA、PDHA、PFKM和PFKFB3，表达增加，以及PFK-1、PFK-2和G6PDH的相对蛋白质水平在3D聚集体中与2D培养相比增加。
通过糖酵解的葡萄糖代谢产生丙酮酸，其被乳酸 dehydrogenase（LDH）还原产生乳酸，同时NADH被氧化为NAD+。在富含谷氨酰胺的条件下，谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转化为α-酮戊二酸（αKG），产生氨作为副产物。PDK1的表达与丙酮酸脱氢酶复合物的调节相关，该复合物在线粒体内将丙酮酸磷酸化为乙酰辅酶A以产生能量。HK2与葡萄糖磷酸化以产生ATP密切相关，以及通过调节线粒体促存活因子和抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）以促进自噬来促进细胞存活。LDHA和PKM2是糖酵解中的关键酶，上调表达是葡萄糖摄取导致
