综述：单分子力谱技术评估SARS-CoV-2关切变异株抑制剂的研究

《European Biophysics Journal》：Single molecule force spectroscopy for evaluating inhibitors of SARS-CoV-2 variants of concern

本综述系统阐述了原子力显微镜（AFM）单分子力谱（SMFS）技术在评估SARS-CoV-2刺突（Spike）蛋白与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体相互作用抑制剂中的应用。该方法通过直接测量单分子水平结合力与解离动力学，揭示了可溶性ACE2（sACE2）及凝集素（Clec4g/hCLEC4G/H84T-Banlec）对多种变异株（Delta/Omicron）的高效抑制机制（IC50达纳摩尔级），为靶向保守结构的广谱抗病毒策略提供了精准生物物理验证。

　　

结合Spike与Vero E6细胞表达的ACE2

SARS-CoV-2感染起始于病毒刺突糖蛋白与宿主细胞受体ACE2的高亲和力结合。为在单分子水平解析该互作机制，研究采用AFM-SMFS技术：将Spike蛋白固定于AFM探针尖端，使其与表达ACE2的Vero E6细胞接触。通过控制探针回撤速度，记录单键断裂时的解离力，并构建力-概率分布函数。研究发现Spike三聚体可像“分子卡尺”同时结合最多三个ACE2受体，解离方式包括顺序断裂与协同断裂。通过贝尔-埃文斯模型计算，武汉株Spike单体的解离速率常数（k_off）为5.2×10^-4±0.4s^-1，结合速率常数（k_on）为0.83×10^5±0.04M^-1s^-1，平衡解离常数（K_D）为6.2×10^-9±0.5M。值得注意的是，Delta变异株Spike的k_off降低近10倍（4.4×10^-5±0.3s^-1），而Omicron株进一步降低100倍（4.2×10^-6±0.1s^-1），这与其增强的传染性密切相关。

可溶性ACE2的抑制作用

为阻断病毒入侵，研究评估了可溶性ACE2的抑制效果。SMFS实验显示，18.5 nM的sACE2即可显著抑制Spike与细胞膜ACE2的结合。通过剂量反应曲线拟合，sACE2对武汉株、Delta和Omicron Spike的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.38 nM、0.28 nM和0.25 nM。尤其值得注意的是，Omicron Spike虽具有更低的K_D值（0.06 nM），但其IC₅₀反而更高，推测因其空间结构更紧凑，sACE2二聚体结合时诱导分子应变所致。这些结果验证了sACE2作为“诱饵受体”在纳摩尔浓度下对多种变异株的高效中和能力。

可溶性凝集素的抑制作用

病毒蛋白的糖基化修饰是免疫逃逸的关键策略，而靶向糖基化模式的凝集素有望成为广谱抗病毒剂。研究发现，小鼠Clec4g和人源CLEC4G可剂量依赖性抑制Spike-ACE2结合，IC₅₀分别为58 nM和36 nM。工程化香蕉凝集素H84T-Banlec通过选择性结合病毒蛋白高甘露糖糖基，对武汉株、Delta和Omicron Spike的IC₅₀分别为5.2 nM、3.9 nM和2.6 nM。其双价特性可通过多价结合增强与Spike三聚体的亲和力。SMFS测得的IC₅₀与细胞实验的半数有效浓度（EC₅₀）高度一致，证实单分子水平数据具有生理相关性。

结论

AFM-SMFS技术能够直接在活细胞膜表面定量表征Spike-ACE2互作的力学参数与抑制机制。该研究揭示了靶向受体结合域与保守糖基化表位的抑制剂（如sACE2与凝集素）对变异株的广谱抑制潜力，为抗病毒药物开发提供了高分辨率生物物理平台。未来结合单分子技术与细胞学验证，有望加速针对新发病毒株的保守结构靶向策略的优化。