《Lab on a Chip》：Label-free monitoring of therapy response in 3D spheroids using lab-on-a-chip impedance spectroscopy
引言
癌症的高发病率和死亡率持续推动着有效疗法的研发。芯片实验室（Lab-on-a-Chip, LOC）平台已成为传统生物学评估方法的有力替代方案，具有复杂性低、成本低和通量高的优点。同时，非侵入性、非破坏性传感技术的整合为实时、无标记分析提供了新的机遇。电阻抗光谱法（Electrical Impedance Spectroscopy, EIS）利用细胞固有的介电特性，在定量评估三维细胞结构方面展现出潜力。本研究展示了基于LOC的EIS技术在评估放疗对三维头颈癌（Head and Neck Cancer, HNC）球体生物效应方面的应用。我们的结果确立了EIS作为一种可行工具，可用于实时监测三维肿瘤模型中治疗引起的变化，支持其在临床前癌症研究和治疗筛选中的潜力。
实验材料与方法
细胞培养与维持
人口腔鳞状细胞癌细胞Cal27（ATCC）根据本课题组先前发表的方法进行培养。细胞在表面处理过的组织培养板（Fisher Scientific）上，使用含有10%外泌体去除胎牛血清（Fisher Scientific）、1%青霉素-链霉素（Fisher Scientific）、1%非必需氨基酸（Fisher Scientific）、1%丙酮酸钠（Fisher Scientific）和1% L-谷氨酰胺（Fisher Scientific）的DMEM（Corning）培养基进行培养。细胞在37°C、5% CO2 条件下的Heracell Vios 160i CO2 培养箱（Fisher Scientific）中孵育。待细胞增殖至约70%汇合度，并在外泌体去除培养基中传代至少2次后，用于球体接种。
球体培养
球体在低吸附性Nunclon Sphera处理U底微孔板（Fisher Scientific）中培养，采用改良的接种方案。简要来说，将组织培养板中的细胞胰蛋白酶消化并制备成细胞悬液。将100 μl细胞悬液以所需细胞密度接种到各个U底孔中。随后使用Allegra X-30R离心机（Beckman Coulter）以500相对离心力（rcf）离心5分钟。肉眼观察确保细胞聚集在孔底。孵育期间，聚集的细胞增殖并生长成三维球体结构。每48小时通过更换100 μl总量中的65 μl培养基进行换液。在换液前的第2、4、7天，使用Eclipse TE2000-5显微镜（Nikon）配备Zyla CMOS相机（Andor）和NIS-Elements软件（Nikon）对球体进行成像。
微流控芯片实验室组装
芯片实验室使用Form 3立体光刻（Stereolithography, SLA）3D打印机（Formlabs）以透明树脂打印。SLA打印的通道喷有干性特氟龙润滑剂（WD-40公司）以防止球体粘附通道壁。组装设备时，将电极插入芯片翼片上的槽中。不锈钢主体置于凹槽中，使引脚暴露以连接外部设备。容纳电极的通道设计有精确公差，以确保准确定位并减少流体泄漏。将PDMS薄片覆盖在通道和电极顶部作为柔性密封盖。将组装体对准底部载玻片，并置于两个3D打印的压缩板之间。然后使用小螺栓和蝶形螺母将SLA通道压缩 against PDMS片，形成可逆密封，便于组装和重复使用。此设置还允许手动控制施加的压力并进行显微镜测量。将组装体翻转180°以便在冲洗、对准球体并进行阻抗测量时观察球体。
球体捕获
用2 μl培养基吸取球体并插入通道前部的样品池附近。设备组装后，使用注射泵（New Era Pump Systems, Inc.）以50 μL min-1 的流速将经0.02 μm无机膜过滤器（Cytiva）过滤的1× PBS泵入流体入口。缓冲液流经通道五分钟，在此期间与培养基混合并携带球体随流移动。通道逐渐变窄至电极间隙为350 μm，由于电极间通道高度降低，球体被捕获。350 μm是名义CAD设计间隙。由于该特征接近Form 3打印机的实际分辨率极限，打印宽度可能因打印设置和后处理而有所偏差；根据制造商报告的容差，我们估计偏差约为±20–100 μm（即约330–370 μm）。此范围足以实现可靠捕获，捕获依赖于逐渐收缩的几何结构而非精确的间隙宽度。捕获结构与样品接触的表面设计为平面以减少尖角造成的损伤。浅而宽的泄流通道允许流体继续围绕球体流动，防止堵塞并降低压力。球体在电极区域的对准主要是被动的，由逐渐收缩的结构实现，并在测量前通过直接显微镜观察确认。实践中，球体的捕获/对中在引入球体后几分钟内完成。流体流动冲洗并替换掉培养基，用1× PBS实现对已对准球体的测量。在捕获区，通道变宽以降低流体压力并将流动导向通道外。每次使用后，拆卸组装体，用异丙醇（Sigma-Aldrich）清洗，压缩空气（Digital Innovations）干燥，并在下次使用前排除入口软管中的气泡。
LabOne数据采集与后处理步骤
阻抗测量采用4端子配置，使用4极不锈钢簇状微电极（FHC；极直径50 μm），电极跨接在捕获收缩处，使球体对准在极间跨越名义350 μm间隙，由HF2LI锁相放大器和HF2TA电流放大器（Zurich Instruments）驱动/记录。实验设置和数据采集通过配套的LabOne软件（Zurich Instruments）控制。施加交流100 mV峰值探测电压。对于1 kHz至10 MHz之间的1000个对数间隔频率点，锁相放大器对电流和差分电压信号进行10次重复测量，并在内部平均，得到每个频率一个数据点（即阻抗谱）。频率扫描耗时远少于1分钟；因此，每个球体的完整运行（加载、捕获/视觉确认、EIS采集）通常需要约5分钟。记录电流和差分电压测量的幅度和相位的电压表示。所有输入通道设置为直流耦合。跨阻增益设置为1 kV A-1 ，电压增益设置为1，以产生合适的信噪比。电流测量采用50 Ω输入阻抗，差分电压测量采用1 MΩ输入阻抗以减少电流泄漏。启用两个测量通道的相位展开功能以减少不连续性，记录的数据从LabOne软件导出。在每个实验会话内获得的重复测量未显示超出典型样本间变异性的系统性时间依赖性偏移，表明在单个球体测量（分钟级）的时间尺度内漂移最小。因此，比较是在会话内使用相同的设备和仪器设置进行的。
波形数据加载到自定义MATLAB脚本中进行数字信号处理和统计分析。该信号处理改编自本研究组先前研究中使用的程序。将幅度和相位波形转换为复数。幅度和相位从锁相放大器导出，并在MATLAB中转换为复数值，以便计算 Z = V/I；这等同于使用锁相放大器的 X/Y 输出。电流波形幅度按因子2缩放，以补偿50 Ω输入阻抗引起的衰减。根据电流放大器制造商指定的传递函数，将测量的电流波形转换为安培。然后使用欧姆定律根据电流和差分电压测量值计算球体的阻抗。为了在离散频率下比较实验组间的测量阻抗，对波形应用15点移动平均滤波器。使用polyfit函数执行多项式逼近，以估计特定感兴趣频率的值用于统计分析。
基于尺寸的评估
以每孔2000和4000个细胞的密度接种球体，培养7天以最大化直径差异。在第7天，吸取单个球体并测量其阻抗，以检测由球体尺寸差异引起的介电特性变化。阻抗测量后立即测量对准球体的光学尺寸，并使用椭圆估算计算面积进行比较。椭圆面积估算通过测量每个球体的垂直和水平直径，并使用相应的半径计算椭圆面积。
球体照射与细胞反应
在接种后第一天，使用Cell Rad+（Precision X-Ray Irradiation）施加160 kV X射线辐射，剂量为4 Gy。在生长第4天，吸取对照组（未处理）和照射组球体的单个样本，使用LOC设备测量其阻抗。为了在细胞水平评估辐射效应，通过蛋白质印迹法测量γ-H2AX、Ki-67和cleaved caspase-3的蛋白水平，采用本课题组先前实验的改良方案。在生长第1天（照射后3小时）收集球体，比较实验组间γ-H2AX的存在。另将球体培养至第4天并收集，以在阻抗测试时检测Ki67、cleaved caspase-3水平以及细胞代谢活性。
蛋白质印迹法
对于蛋白质印迹，将45个球体合并，以500 × g离心5分钟，在微管底部形成沉淀。去除上清液并储存于-80°C。用冰预冷1× PBS洗涤球体沉淀3次，并重悬于50 μl RIPA缓冲液加蛋白酶抑制剂中。将裂解液混合，然后在超声波水浴（VWR Symphony）中用冷水进行3个循环的1分钟超声和1分钟静置。然后将悬浮液在冰上再孵育10分钟。
从裂解液中获取20 μg蛋白质，并与4× Laemmli缓冲液（Bio-Rad）混合，为凝胶电泳制备混合物。在95°C孵育5分钟后，在NuPAGE 12%， Bis-Tris, 1.0 mm, Mini-PROTEAN TGX预制胶（Bio-Rad）中运行50分钟，并使用Trans-Blot Turbo系统（Bio-Rad）印迹到PVDF膜上。用EveryBlot封闭缓冲液（Bio-Rad）封闭膜，然后与1:1000抗γ-H2AX（Abcam）、抗Ki67（Abcam）和抗cleaved caspase-3抗体（Abcam）在4°C孵育过夜。洗涤膜，并用1:1000山羊抗兔（Abcam）和山羊抗鼠（Abcam）二抗（视情况而定）在25°C孵育1小时进行标记。使用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）显色检测信号，并使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad）捕获。使用ImageJ软件（NIH, USA）量化条带强度，并归一化至β-肌动蛋白水平进行统计分析。
细胞活力测定
使用CyQUANT MTT细胞活力测定试剂盒（Invitrogen）进行MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）比色测定，改编自制造商方案，简要描述如下。对于每个实验组，将6个球体以500 × g离心5分钟，并重悬于100 μl TrypLE（Gibco）中将球体解离成单细胞悬液。将所得悬液再次以500 × g离心5分钟，并重悬于100 μl新鲜培养基和10 μl 12 mM MTT储备液的混合物中。制备不含细胞的培养基和MTT储备液的空白混合物用于基线比较。将细胞在溶液中于37°C孵育2小时。孵育后，离心细胞悬液，去除85 μl上清液。加入50 μl DMSO（Fisher BioReagents）并彻底混合。孵育10分钟后，将全部75 μl体积转移至平底微孔板（Thermo Scientific），使用BioTek 800 TS微孔板读数仪（Agilent）在540 nm波长下测量吸光度。
统计分析
每个实验组测量5个重复球体的阻抗，并取在感兴趣频率范围内标准偏差最小的3个球体谱进行统计分析。使用GraphPad Prism 9（GraphPad）进行统计检验。每个实验独立重复3次，结果制表以观察可重复的显著差异。
数据点表示为平均值±标准偏差。对3个样本的阻抗或不透明度幅度在单个感兴趣频率下进行非配对t检验，比较其平均值。基于正态性检验假设高斯分布。当相应的F检验产生p值大于0.05时，假设样本间标准偏差相等。如果F检验具有统计学显著性，则执行带Welch校正的t检验以考虑不等标准偏差。每次评估均作为双尾检验进行，置信区间为95%，p值阈值为0.05。
结果
通过EIS评估球体尺寸
为了评估阻抗测量系统在检测球体尺寸差异方面的性能，培养了起始密度为2000和4000个细胞的球体7天。在第7天，收获球体，每个球体在LOC的传感电极间对准进行阻抗测量。与以2000个细胞接种的球体相比，以4000个细胞接种的球体面积显著增加。以2000个细胞接种的球体平均面积为0.0446 ± 0.0058 mm2 ，平均最大直径为250.29 ± 8.05 μm。以4000个细胞接种的球体生长得更大，平均面积为0.0708 ± 0.0065 mm2 ，平均最大直径为310.80 ± 20.20 μm。对10 kHz至10 MHz频谱的阻抗幅度分析表明，在10 kHz至100 kHz的较低频率范围内，阻抗增加更为显著，可用于检测球体尺寸。在10 kHz至100 kHz范围内6个规则间隔的离散频率下的进一步检查显示，在20 kHz至100 kHz之间阻抗存在显著增加。阻抗幅度的平均差异为1.043 ± 0.286 kΩ，在20 kHz时最大增加1.34倍。实验重复三次，在60 kHz至100 kHz的3个离散频率下观察到重复的显著差异。
通过不透明度归一化减小尺寸和对准影响
为了减少样品尺寸和电极间位置对测量阻抗的影响，可将信号归一化为不透明度比。不透明度比通过将每个频率的阻抗幅度Z(f)除以尺寸依赖性参考频率Z(fref )（60 kHz）的阻抗幅度来计算。将以2000和4000个细胞起始密度接种的球体的测量阻抗归一化为不透明度比。将所得不透明度幅度进行比较，以确定尺寸不同的球体内其他方面相同的细胞其电学特性是否保持一致。当比较实验组的阻抗谱时，在10 kHz至100 kHz之间观察到最显著的差异，较小的阻抗差异延续到300 kHz以上。归一化后，在400 kHz至2 MHz之间的离散频率下，相应的不透明度幅度无显著差异。这种归一化揭示了在补偿了球体直径差异对阻抗的尺寸依赖性后，球体内细胞具有等效的介电特性。
通过EIS评估照射对球体的影响
为了评估照射对三维球体引起的介电特性变化，在照射后3天比较了对照组和照射组球体的不透明度幅度。清洗球体并在LOC设备的传感电极间对准。测量其阻抗，并使用尺寸依赖性参考频率60 kHz转换为不透明度幅度。在宽频谱上比较不透明度幅度谱表明，照射球体的不透明度从200 kHz到3 MHz增加。在离散频率下的进一步检查显示，从200 kHz到3 MHz，不透明度幅度存在显著差异。不透明度幅度的平均差异为0.109 ± 0.0270，照射球体在1 MHz时最大增加1.36倍。研究在3个独立实验中重复进行，在从400 kHz到900 kHz以及从2 MHz到3 MHz评估的八个频率下发现重复的显著差异。
球体对辐射反应的生物分子评估
为了研究可能影响测量不透明度变化的放疗效应，对球体进行了相关蛋白标志物检测。蛋白质印迹分析表明，照射后3小时，照射组中DNA损伤标志物γ-H2AX的蛋白表达增加。凋亡指标cleaved caspase-3的表达也增加，而Ki-67表达减少，反映了阻抗测量时照射球体内增殖减少。测量肌动蛋白表达作为上样对照。蛋白质印迹强度量化显示，与对照组相比，照射球体中γ-H2AX水平的平均相对表达增加至1.35 ± 0.12，Ki67降低至0.54 ± 0.084，cleaved caspase-3增加至1.31 ± 0.11。使用MTT测定证实了活力差异，照射球体的代谢活性显著降低，平均相对表达为对照组的84.51 ± 7.90%。
讨论
在本研究中，我们开发并利用了一个集成的LOC-EIS平台来测量三维HNC球体对放疗的电阻抗变化。发现面积较小的球体在60 kHz至100 kHz的较低频率下阻抗幅度降低。这证实了先前的发现，即光学直径较小的球体在60 kHz下具有较低的阻抗幅度，并表现出形状、均匀性和方向的适度变异性。虽然先前的研究在有限数量的离散频率上报告了这种趋势，但我们的研究在更宽的频率范围内以更精细的间隔进行了分析，为细胞对放疗的反应行为提供了关键见解。
为了解释阻抗测量中尺寸和位置依赖性的变异，使用不透明度比对信号进行归一化。以2000和4000个细胞接种的球体之间的阻抗幅度差异在较低频率最为普遍，在较高频率程度较轻。这些发现与报道的研究一致，这些研究模拟了二维细胞簇随着细胞层数增加（模拟直径增加）的结果。在我们的研究中，使用尺寸依赖性参考频率60 kHz的不透明度比对阻抗测量进行归一化，以减轻球体尺寸和位置的影响。选择60 kHz参考频率是因为其已证明与尺寸相关，并先前用于评估球体内的细胞活力。在尺寸不同的球体中观察到的不透明度比无显著差异表明球体内细胞具有相似的介电特性，与球体整体直径无关。这种归一化使得能够辨别介电特性的细微变化，而不受球体尺寸和位置变异的影响。
我们接下来利用我们的LOC-EIS平台，在较高频率范围内使用阻抗谱评估治疗反应。随着辐射生效，球体内的细胞开始死亡，导致细胞活力降低与球体整体直径减小之间存在强相关性。尺寸减小将可通过其在60至100 kHz低频范围内产生的尺寸依赖性阻抗幅度检测到。相反，如果由于辐射剂量不足或复苏导致球体继续生长，则将在同一低频范围内对应不同的阻抗幅度。细胞活力与球体尺寸之间的这种关系为低频阻抗监测在检测球体表型细微变化方面提供了有价值的应用。还使用不透明度比评估了照射球体的介电特性，以最小化尺寸依赖性误差。照射球体在400至900 kHz以及2至3 MHz范围内显示出不透明度显著增加，对应于β-色散区。在这些区制的背景下，用于球体尺寸区分的较低频率窗口（10–100 kHz）位于β-色散区的低端，其中测量的阻抗幅度受球体几何形状、堆积密度以及围绕/穿过聚集体的有效导电路径的强烈影响。用于评估辐射反应的较高频率窗口（≈200 kHz–3 MHz）落在β-色散区内，其中膜完整性和细胞内组成的变化预计会影响有效介电特性，从而调制不透明度信号。虽然仪器采集频谱高达10 MHz，但我们未在本文中解释最高频率区域，因为寄生电容/电感在接近10 MHz时预计变得日益显著。因此，本研究的有效分析带宽由产生可重复频谱和统计学显著组间差异的频率范围（高达~3 MHz）定义。这种不透明度的增加与先前报道的热处理球体不透明度增加以及球体阻抗对药物处理反应改变的研究一致。
β-色散区内频率的增加使得电场能够渗透细胞并与细胞膜和带电内容物相互作用，这些在球体内的修复和凋亡过程中发生改变。为了将辐射引起的不透明度增加与此类变化关联，我们对辐射效应的关键生物分子指标进行了蛋白质印迹分析。先前已确定细胞浓度是改变三维培养物阻抗的关键因素。在我们的研究中，发现照射球体中Ki-67表达低于对照组，表明治疗反应中增殖减少。照射球体内细胞增殖减少导致簇内细胞减少，改变了总电阻和电容特性，影响阻抗。这些电学特性的改变进而可能导致我们实验组间检测到的不透明度增加。
在细胞水平上，辐射诱导的DNA损伤触发照射后不久γ-H2AX的磷酸化，表明双链断裂的存在和程度。我们观察到照射球体中γ-H2AX表达增加，验证了细胞内辐射诱导的DNA损伤，并提供了辐射诱导带电细胞内容物变化促成检测到的不透明度幅度增加的例证。这证实了先前的阻抗研究，这些研究将测量的不透明度变化归因于位于膜和腔内的带电分子差异。此外，我们还观察到照射球体内cleaved caspase-3表达增加，表明凋亡增加。使用MTT测定也证实了活力差异，显示照射球体的代谢活性显著降低。垂死细胞的受损膜在体外平台中未被清除，据报道由于肿胀和膜裂解导致更高的膜电导率和增加的不透明度比。因此，我们照射组不透明度的增加也可归因于凋亡增加，其中膜破裂通过增加电导率、破坏膜电容并将间质液释放到细胞外空间来降低细胞阻抗。总体而言，我们的生物学评估初步揭示了球体内潜在的生物分子变化，这些变化可能导致观察到的球体不透明度对辐射的反应。然而，本研究使用单一HNC细胞系进行，可能限制普适性，因为辐射敏感性可能因癌症类型而异。未来结合其他HNC亚型和其他癌症模型的研究对于更广泛的验证非常重要。尽管如此，我们的研究结果作为快速、微创LOC-EIS在评估三维肿瘤模型治疗反应中应用的概念验证。
结论
推进用于生物学评估的LOC技术可以显著降低开发和评估新型癌症疗法的障碍。整合无标记和非侵入性方法，如利用细胞介电特性的EIS，在这方面展现出潜力。将EIS纳入LOC实现了对三维球体中放疗诱导变化的定量评估。除了将宽带EIS应用于完整的三维球体，本工作的一个关键贡献是微流控捕获与测量架构，能够在确定的传感体积内稳定、可重复地 interrogation 单个球体。通过将被动捕获与支持快速设计迭代的模块化组装相结合，该平台为可扩展和用户友好的球体介电表征提供了一条实用途径。这种方法具有扩展设计的潜力，可能进一步提高灵敏度，并实现通过介电特性实时跟踪球体降解。总体而言，我们的研究结果支持基于LOC的EIS在检测生理相关三维模型中治疗反应的更广泛应用，突出了其在癌症研究和药物开发中的前景。
作者贡献
G. M., M. S. (Sheth), 和 L. E. 构思并设计研究。G. M., M. S. (Sheth), M. S. (Sharma), S. K., 和 M. L. 进行实验。数据由 G. M., M. S. (Sharma), 和 S. K. 整理和正式分析。实验结果由 G. M., M. S. (Sheth), M. S. (Sharma), S. K., 和 L. E. 验证和解释。图表和初稿由 G. M. 准备。手稿由 M. S. (Sheth), S. K., T. W. D., V. T., 和 L. E. 编辑。监督、资金获取和项目管理由 L. E. 提供。所有作者审阅并批准了手稿的最终版本。
利益冲突
作者声明无任何竞争性或财务利益。
数据可用性
本研究期间生成和分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。支持本研究结果的已处理阻抗谱、成像数据和蛋白质印迹定量分析包含在文章及其补充信息（SI）文件中。用于数据处理的定制MATLAB脚本也可根据要求从通讯作者处获得。
致谢
本工作由国家科学基金会NSF CAREER ECCS（2046037）资助Leyla Esfandiari。LOC原型的制造和开发得到Colleen Arrasmith的支持。图表使用
https://BioRender.com 创建。
