《Journal of Advanced Research》：A DNA triangular prism scaffold-guided directionally-controlled derailment-free DNAzyme walker
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本研究针对传统DNA行走器在均匀溶液中运动方向不可控、易从预设轨道脱轨的难题，构建了一种基于DNA三角棱镜（DTP）支架的三维DNAzyme（D-walker）行走器。研究证实，该行走器能够依据空间距离依次切割底物，实现了高度定向、可控的运动，且完全避免了脱轨现象。此研究为开发高灵敏度生物传感器和靶向癌症治疗新策略提供了新工具。
在微观的纳米世界里，科学家们一直梦想着创造出能够像机器人一样自主、定向行走的分子机器。DNA，这种承载生命遗传密码的分子，因其卓越的可编程性和精确的碱基互补配对原则，成为了构建这类纳米机器的理想材料。其中，DNAzyme（脱氧核酶）是一类具有催化功能的单链DNA分子，而DNAzyme行走器则是一种能够在特定轨道上移动并执行切割任务（如切割RNA）的动态纳米器件。它们在生物传感、疾病诊断和治疗等领域展现出巨大潜力。然而，尽管经过多年发展，如何精确控制这些分子机器在溶液中的运动方向，确保它们沿着预设路径前进而不“脱轨”，仍然是一个巨大的挑战。传统的二维（2D）DNA行走器虽然提供了更多的运动自由度，但其运动方向难以控制；而一些三维（3D）行走器虽然增加了运动空间，但随机碰撞和脱轨问题依然突出，限制了其执行效率和实际应用。
为了攻克这一难题，来自福州大学的研究团队在《Journal of Advanced Research》上发表了一项创新性研究。他们巧妙地利用DNA纳米技术，构建了一种刚性的DNA三角棱镜（DNA Triangular Prism, DTP）作为三维支架，用以引导一种特殊的DNAzyme（称为D-walker）进行定向、可控的“行走”。这项研究的目标非常明确：解决DNA行走器运动方向的不确定性和易脱轨的问题。
研究人员开展的核心工作是设计并组装了DTP支架，该支架具有多个“粘性末端”，可以像插座一样精确地安装DNAzyme行走器和三种不同的RNA底物（S1, S2, S3）。DNAzyme行走器最初被固定在其中一个底物（S3）上。当加入镁离子（Mg2+）作为辅助因子后，DNAzyme被激活，开始其切割之旅。关键在于，研究人员通过精心设计底物在DTP支架上的空间排布，来控制DNAzyme的移动路径。他们的研究发现，DNAzyme并非随机切割周围的底物，而是严格按照由近及远的顺序进行：首先切割与其直接接触的S3，然后“走”向空间距离最近的S2进行切割，最后才切割距离最远的S1。这种切割顺序完全依赖于底物与DNAzyme之间的空间距离，而与底物本身的序列特性无关。凝胶电泳实验清晰地展示了这种按时间顺序出现的切割产物条带，证明了行走的方向性和可预测性。
更令人振奋的是，这种DTP引导的行走器展现出了卓越的“防脱轨”能力。即使溶液中存在大量游离的、未被固定在支架上的底物，DNAzyme也会紧紧“抓住”支架轨道上的底物进行切割，而对溶液中的游离底物“视而不见”。这彻底解决了传统DNA行走器因脱轨而导致效率低下的瓶颈问题。此外，该研究还证明，通过调整底物在支架上的排列（例如，串联多个相同底物）或引入DNA间隔子来改变有效距离，可以灵活地编程控制DNAzyme的行走路径和切割顺序，实现了对行走过程的高度可控。
这项研究的成功，意味着一种新型的、高性能的分子马达的诞生。这种DNA三角棱镜引导的DNAzyme行走器，兼具三维结构提供的广阔运动空间和定向运动带来的高效率，同时避免了脱轨的困扰。它不仅为理解分子水平的运动机制提供了理想模型，更在生物传感领域展现出广阔前景。例如，其高效、定向的信号放大能力可用于检测极低浓度的疾病标志物，为癌症等重大疾病的早期、高灵敏度诊断开辟了新途径。同时，这种可编程的、定向运动的纳米机器也有望用于智能药物递送和精准基因治疗，为生物医学研究注入新的活力。
为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术：1. DNA纳米结构的层次化自组装：通过精确设计DNA序列，利用退火等步骤可控地组装出刚性的DNA三角棱镜（DTP）支架。2. 变性/非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE/nPAGE）：用于分析和验证DNA组件的纯度、DTP支架的组装效率以及DNAzyme切割底物产生的产物。3. 荧光光谱分析：用于优化DNAzyme切割反应所需的Mg2+浓度。4. 距离可控的酶切动力学分析：通过设计不同空间排布的DTP变体（DTP-1至DTP-14），系统研究DNAzyme切割底物的顺序与空间距离的关系。
结果与讨论
DNA三角棱镜（DTP）支架的构建与表征
研究首先成功构建了DTP支架。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（nPAGE）验证了DTP各组分的逐步组装过程以及最终完整支架的形成，表明组装效率较高。
DNAzyme在DTP支架上的安装与活性
实验证实，DNAzyme能够成功通过碱基配对安装到DTP支架的特定位点（如S3底物上），并且其切割活性在支架上得以保持。优化实验确定10 mM为Mg2+辅助因子的最佳浓度。
距离依赖性切割与定向运动分析
这是本研究的核心发现。通过设计四种不同的DTP构型（DTP-1至DTP-4），将三个底物（S1, S2, S3）以不同空间顺序排列在DTP支架上。dPAGE分析结果显示，在所有情况下，DNAzyme都优先切割与其空间距离最近的底物，然后是次近的，最后是最远的。例如，在DTP-1中，切割顺序为S3 -> S2 -> S1；在DTP-2中，顺序为S3 -> S1 -> S2。定量分析进一步证实了这种严格的距离依赖性切割行为，表明DNAzyme的行走方向是由其与各底物的相对空间距离决定的，而不受底物类型或所在棱镜面的影响。
行走过程中紧密锚定轨道以防止脱轨
为了验证防脱轨特性，研究人员设计了DTP-5、DTP-6和DTP-7，在这些构型中，部分底物未被固定在支架上而是游离在溶液中。dPAGE结果清晰显示，DNAzyme只切割固定在支架上的底物，而对溶液中游离的底物没有任何切割活性。这证明DNAzyme通过其较长的识别臂（15个碱基）在切割后仍能稳定地锚定在支架上，有效避免了从预设轨道上脱轨。
DNAzyme对多个底物的定向切割
研究进一步展示了DTP行走器的高过程性（进行多步移动的能力）。通过在设计好的DTP支架（DTP-8至DTP-12）上串联安装多个相同或不同的底物，实验证明DNAzyme能够依次切割这些底物。切割顺序同样严格遵循空间距离的由近及远，即使底物数量增多，其定向行走的特性依然保持。
轨道空缺对DNAzyme定向切割底物的影响
通过引入双链DNA（ds-DNA）间隔子（Spacer）来增加底物与DTP支架骨架之间的距离（DTP-13, DTP-14），研究发现这会导致相应底物的切割时间延迟。这进一步证实了空间距离是控制切割顺序和行走路径的关键因素，并且可以通过设计间隔子来主动编程控制行走行为。
结论
本研究成功构建了一种由DNA三角棱镜（DTP）支架引导的DNAzyme行走器。该行走器能够实现高度定向、可控的运动，其切割底物的顺序严格遵循空间距离的由近及远。更重要的是，它完全克服了传统DNA行走器易脱轨的难题，展现出优异的过程性（能连续进行多步反应）和方向可控性。与一维（1D）和二维（2D）DNA行走器相比，该三维（3D）行走器解决了运动空间受限和过程性低的问题；与已有的其他三维行走器相比，它实现了运动方向的可控，避免了随机运动。由于其具有设计简单、成本低、可编程性强、切割特异性高和方向可控等优点，这种DTP引导的DNAzyme行走器在生物传感、疾病诊断（特别是癌症的早期诊断）以及靶向治疗等领域具有巨大的应用潜力，为下一代信号放大生物传感器的开发奠定了坚实基础。未来的研究将侧重于利用单分子方法精确量化其运动动力学，并在复杂的体内环境中验证其功能。
