《Biotechnology Progress》：A case study showing the role of hydrophobicity variants and other enriched mAb proteoforms on filterability through a virus filter with productivity improvement measures
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本综述通过混合模式色谱技术富集单克隆抗体（mAb）不同蛋白形态（proteoform），系统评估了疏水性变异体、电荷变异体、糖基化变异体及高分子量（HMW）物种对病毒过滤器（VF）膜污染的影响。研究结合圆二色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、动态光散射（DLS）及尺寸排阻色谱（SEC）等生物分析技术，揭示了高疏水性变异体（如HIC V7）、甘露糖-5（Man-5）糖型及碱性电荷变异体在终端洗脱亚池（如亚池I）中富集，并显著导致Viresolve Pro（VPro）病毒过滤器通量衰减。研究为下游纯化工艺中靶向去除易聚集蛋白形态提供了设计空间，对改善难过滤性单抗的生产可行性（manufacturability）具有重要指导意义。
1 引言
单克隆抗体（mAb）在生物制药产业中占据重要地位，其全球销售额预计在2025年将超过3000亿美元。病毒过滤（VF）是下游纯化过程中的关键单元操作，也是法规要求的步骤，用于去除病毒等杂质。然而，VF膜易被单抗污染，导致通量衰减，成为下游生产的瓶颈。传统上，单抗的生产可行性评估多以整个收获池为单位进行，但更精细的方法在于评估单抗批次内不同蛋白形态（proteoform）对膜污染的贡献。这些微异质变异体在表面电荷、疏水性、流体力学直径、胶体稳定性及糖型等方面存在差异，可能通过机械堵塞或吸附性结垢等机制污染VF膜。
疏水性变异体的概念已较为明确，其由单抗蛋白形态的高阶结构决定，抗体多肽链中疏水性残基的暴露或隐藏会导致表面疏水性的差异。研究表明，导致病毒过滤器污染的单抗组分主要是含有更多暴露疏水表面的单体变异体。这些疏水性变异体可能通过自身关联形成聚集体，或吸附在过滤膜上导致通量衰减。本研究利用混合模式色谱树脂（Eshmuno CMX）将单抗池按蛋白形态和糖型富集为多个亚池，并评估各亚池的过滤性能及相关生物物理属性，以识别导致VF膜污染的关键变异体。
2 材料与方法
2.1 材料
研究使用Eshmuno CMX混合模式树脂（具有弱阳离子交换和中等疏水相互作用特性）填充色谱柱，对经离子交换抛光后的单抗mAb 12（IgG1，pI 8.2）进行分级分离。洗脱采用pH阶跃梯度，从低导电性缓冲液（pH 6.7）至高pH洗脱缓冲液（pH 9.2），收集9个洗脱亚池（A–I）。各亚池及未分级原料均换液至相同缓冲条件（35 mM Tris acetate, 15 mM NaCl, pH 8）后，进行病毒过滤测试（使用Viresolve Pro病毒过滤器）及多种生物分析检测。
2.2 方法
病毒过滤实验将各样品（5 g/L）在30 psi下过滤，通过VPro微型设备（有效过滤面积3.4 cm2）测定质量通量（g/m2）和归一化通量（J/J0）。生物分析包括：尺寸排阻色谱（SEC）定量高分子量（HMW）物种、单体和低分子量（LMW）片段；动态光散射（DLS）测定流体力学半径和扩散相互作用参数（kD）；分析型疏水相互作用色谱（HIC）评估相对疏水性；成像毛细管等电聚焦（icIEF）分析电荷变异体；糖基化定量分析；圆二色谱（CD）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）探测高阶结构差异。
3 结果与讨论
3.1 色谱分级
采用Eshmuno CMX树脂的pH阶跃洗脱成功将mAb 12分为多个蛋白形态富集的亚池。混合模式机制（弱阳离子交换加疏水相互作用）增强了树脂对单抗变异体的选择性。早期洗脱的亚池（如A）富含酸性电荷变异体，而晚期洗脱的亚池（如I）则富集了碱性电荷变异体、高疏水性变异体及特定糖型。
3.2 尺寸排阻色谱和动态光散射
SEC结果显示，亚池A和I的HMW物种比例较高（分别为6.8%和7.9%），而未分级原料的HMW为0.7%。LMW物种在所有亚池中均低于0.3%，表明其对VF膜污染的贡献较小。DLS显示亚池I的平均流体力学半径最大（5.9 nm），略高于原料（5.8 nm），提示其具有更高的聚集倾向。扩散相互作用参数kD在所有亚池和原料中均呈高度负值（-13至-16.4 mL/g），表明所有mAb 12变异体均存在强烈的分子间吸引力（可逆聚集倾向），这可能是导致其普遍过滤困难的原因之一。
3.3 相对疏水性、CD光谱和FT-IR光谱
HIC分析显示，疏水性变异体（V1-V7）的分布随洗脱顺序发生变化。最疏水的变异体V7在亚池I中富集最高（5%，约为原料的3.85倍），而在亚池A中比例最低（0.8%）。亚池I中V7的富集与其在VPro过滤器上最差的过滤性能相关。CD光谱显示各亚池二级结构总体相似，但亚池I的弯曲（bends）比例最高（12.9%），微小构象差异可能导致疏水斑块暴露。FT-IR光谱未检测到亚池间显著二级结构差异，支持变异体异质性处于微观水平。
3.4 糖基化和电荷变异体分析
糖基化分析表明，高甘露糖糖型Man-5和G0F-N在晚期洗脱亚池（如I）中显著富集（Man-5从亚池A的0.6%增至亚池I的6.9%）。电荷变异体分析显示，酸性变异体比例从亚池A的95.3%降至亚池I的11.3%，而碱性变异体在亚池I中增至47.5%。Eshmuno CMX树脂的混合模式特性同时实现了电荷和疏水性变异体的分离。
3.5 病毒过滤
病毒过滤测试表明，未分级mAb 12原料过滤性能差（最终质量通量51.47 g/m2）。分级后，中间洗脱的亚池（D-G）过滤性能改善3-6倍，而首尾亚池（A和I）污染最严重。亚池I（富集V7、Man-5、碱性变异体和HMW物种）和亚池A（HMW比例高）的通量衰减最快。过滤性能与HMW比例、高疏水性变异体（V7）富集度及特定糖型（Man-5）呈负相关。
4 结论
本研究通过蛋白形态富集亚池的精细评估，揭示了mAb 12病毒过滤污染的多种机制：包括高疏水性变异体（V7）驱动的聚集、HMW物种的机械堵塞以及高度负值的kD所预示的可逆聚集。快速生物分析评估（如HIC、SEC、kD）可在病毒过滤前预测单抗的过滤难度。下游团队可据此向上游工艺反馈，或通过色谱峰切割、预过滤等方式在纯化过程中去除问题蛋白形态（如V7、Man-5），从而改善难过滤性单抗的生产可行性。未来研究需关注去除特定变异体对单抗生物活性的影响。
