反应诱导自组装纳米网络通过时空协同多药递送治疗急性肾损伤

《BMEMat》：Nano-networks via reaction-induced self-assembly coordinate spatiotemporal multi-drug delivery for acute kidney injury therapy

本文报道了一种通过反应诱导自组装（RISA）构建的多功能纳米网络（NNWs），该网络由亚精胺（SPD）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、2-甲酰基苯硼酸（2-FPBA）和去铁胺（DFO）通过动态亚胺硼酸酯键自组装而成。该纳米网络能够响应急性肾损伤（AKI）的氧化微环境触发解离，实现药物的靶向释放，通过整合铁死亡抑制（DFO和EGCG螯合Fe离子）、氧化应激清除（EGCG和SPD协同清除ROS）和炎症调节（抑制NF-κB和NLRP3通路），多通路协同打破AKI的恶性循环，在体内外均展现出显著的肾脏靶向性和治疗功效，为复杂疾病的组合纳米疗法提供了新策略。

1 引言

急性肾损伤（AKI）是一种以肾功能迅速丧失为特征的严重疾病，与高发病率和高死亡率相关。其病理过程涉及肾小管损伤、氧化应激和炎症的恶性循环。当前临床治疗手段，如皮质类固醇和抗氧化剂（如N-乙酰半胱氨酸NAC），因靶向性差、生物利用度短以及无法协同调控多条病理通路而疗效有限。近年来，尽管先进药物递送系统和仿生酶平台被探索用于AKI治疗，但在同时递送多种功能药物分子以协调调控铁死亡、氧化应激和炎症方面仍面临挑战。本研究通过反应诱导自组装（RISA）策略，构建了由亚精胺（SPD）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、2-甲酰基苯硼酸（2-FPBA）和去铁胺（DFO）组成的四组分纳米网络（NNWs），利用动态亚胺硼酸酯键实现药物的协同递送和氧化微环境响应性释放。

2 结果

2.1 NNWs的构建与表征

NNWs通过将DFO、SPD、2-FPBA和EGCG按摩尔比2:1:4:2在水中顺序混合1小时合成。所得NNWs悬浮液显示出明显的丁达尔效应，平均尺寸为133.40 ± 4.44 nm，多分散指数（PDI）约为0.3，zeta电位约为-26.5 mV，表明其具有良好的胶体稳定性。NNWs在30天内尺寸和PDI保持稳定。透射电子显微镜（TEM）图像显示NNWs呈球形形态，元素映射表明碳（C）、硼（B）、氮（N）和氧（O）均匀分布。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）分析证实了亚胺硼酸酯键的形成。在模拟AKI氧化微环境的过氧化氢（H₂O₂，100 μM）处理下，NNWs尺寸迅速增大，结构被破坏，表现出pH和活性氧（ROS）响应性释放行为。

2.2 NNWs有效清除细胞内外ROS

NNWs在多种体外ROS清除实验（DPPH、ABTS、超氧阴离子、H₂O₂）中表现出显著的清除能力，尤其在ABTS清除中，在2 μg/mL浓度下即可达到100%清除率。在人肾小管上皮细胞（HK-2）中，NNWs能有效降低由H₂O₂诱导的细胞内ROS水平，其效果优于物理混合物（MIX）。在H₂O₂共培养模型中，NNWs以浓度依赖性方式保护HK-2细胞活力，在160 μg/mL浓度下使细胞活力提高约40%。

2.3 缓解铁死亡相关氧化应激

NNWs表现出强大的Fe²⁺螯合能力，在3.91 μg/mL浓度下几乎完全螯合20 μM Fe²⁺。在HK-2细胞中，NNWs处理显著减少了由FeCl₃诱导的细胞内铁积累，效果优于MIX。定量PCR（qPCR）和Western blot分析显示，NNWs处理下调了铁死亡相关基因核受体辅激活因子4（NCOA4）和长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）的表达，同时上调了抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达，表明NNWs通过DFO和EGCG的铁螯合作用以及调节关键基因表达来抑制铁死亡。

2.4 缓解巨噬细胞炎症

在小鼠巨噬细胞RAW264.7中，NNWs有效清除了细胞内ROS并螯合了Fe³⁺。在脂多糖（LPS）刺激的炎症模型中，NNWs处理显著下调了NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体、核因子κB（NF-κB）以及下游促炎细胞因子白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的基因表达，其抗炎效果优于单一组分或其物理混合物，表明NNWs通过调节NLRP3和NF-κB信号通路发挥抗炎作用。

2.5 NNWs在小鼠AKI模型中靶向肾脏

在甘油诱导的小鼠AKI模型中，静脉注射Cy5标记的NNWs后，荧光成像显示NNWs在AKI小鼠肾脏中的积累和滞留显著高于健康小鼠。在AKI小鼠中，NNWs在肾脏的荧光强度在注射后12小时仍可检测到，且肾脏积累量是健康小鼠的3.9倍。共聚焦显微镜观察显示NNWs在肾组织切片中与肾损伤分子1（KIM-1）标记的损伤区域共定位，证实了其肾脏靶向能力。

2.6 AKI的治疗效果

在AKI小鼠模型中，与PBS、NAC或MIX处理相比，NNWs治疗显著降低了血清肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）水平，使其接近健康小鼠水平。同时，NNWs治疗还显著降低了血清中的乳酸脱氢酶（LDH）、KIM-1、血红素氧合酶1（HO-1）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）等肾损伤标志物，以及促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平。血清铁离子浓度在NNWs治疗后也显著降低。肾脏组织中的相关生物标志物变化与血清结果一致，证实了NNWs在恢复肾功能、减轻氧化应激、DNA损伤和炎症方面的综合疗效。

2.7 组织学分析

肾脏组织的免疫荧光染色显示，NNWs治疗显著降低了活性氧（ROS）水平（通过DHE染色评估），提高了GPX4蛋白表达，并降低了铁蛋白轻链（FTL）含量。苏木精-伊红（H&E）和过碘酸-雪夫（PAS）染色表明，NNWs治疗有效改善了肾小管损伤、刷状缘丢失和管型形成等病理变化。普鲁士蓝染色显示NNWs减少了AKI肾脏中的铁沉积。

2.8 NNWs治疗AKI的机制

RNA测序（RNA-seq）分析显示，与PBS处理的AKI小鼠相比，NNWs处理的小鼠肾脏组织中有2403个基因表达发生显著变化，其中1401个基因上调，1002个基因下调。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，NNWs处理下调了与白细胞迁移、NF-κB转录因子活性、IL-6产生等相关的促炎通路，同时上调了与脂质稳态、谷胱甘肽代谢过程、过氧化物酶体功能等相关的抗氧化通路。基因集富集分析（GSEA）进一步证实NNWs促进了谷胱甘肽代谢和过氧化物酶体生物合成通路，同时抑制了IL-6产生和炎症反应通路。

2.9 生物相容性评估

体外溶血实验表明，即使在250 μg/mL浓度下，NNWs的溶血率也低于4%。HK-2细胞活力实验显示，在250 μg/mL浓度下细胞活力仍高于85%。体内血液常规分析和主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色未发现NNWs（25 mg/kg）引起显著毒性或病理改变，证明了其良好的生物相容性。

3 讨论

AKI的病理过程涉及氧化应激、炎症和铁死亡的复杂相互作用。NNWs通过RISA策略将DFO、EGCG和SPD整合到稳定的纳米网络中，克服了单一药物生物利用度低、半衰期短和靶向性差的问题。NNWs利用AKI肾脏的渗漏结构和氧化微环境实现靶向积累和刺激响应性药物释放。DFO和EGCG通过螯合铁离子抑制铁死亡，而EGCG和SPD则协同清除ROS并调节炎症通路。RNA-seq分析揭示了NNWs通过调控谷胱甘肽代谢、过氧化物酶体功能以及抑制NF-κB和NLRP3等炎症通路，多维度干预AKI病理进程，展现出超越传统单药治疗的协同治疗优势。

4 结论

本研究成功构建了一种基于反应诱导自组装的多功能纳米网络，用于急性肾损伤的时空协同多药治疗。NNWs能够靶向积累于损伤肾脏，响应氧化微环境释放活性药物，通过协同抑制铁死亡、清除活性氧和调节炎症，有效打破AKI的恶性循环，恢复肾功能。该平台为复杂疾病的多通路协同治疗提供了新思路，具有广阔的临床转化前景。