《Macromolecular Bioscience》：In Vivo Evaluation of Injected and Bioprinted Hyaluronic Acid-Based Bioink in Corneal Stromal Pocket
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本研究创新性地评估了透明质酸（HA）基生物墨水作为细胞载体在角膜基质修复中的应用。通过体内实验证明，无论是可注射形式还是3D生物打印构建体，该生物墨水均能良好整合于大鼠角膜基质，显著降低基质厚度，维持人脂肪干细胞来源的角膜基质细胞（hASC-CSKs）的表型（如Lumican表达），并促进早期基质重塑。尽管存在炎症反应，但生物墨水有效屏蔽了移植细胞的免疫排斥，凸显了其在未来角膜治疗中的巨大潜力。
引言
角膜混浊是全球范围内导致视力丧失的主要原因之一，而角膜移植术虽为金标准却受限于供体短缺。人脂肪组织来源的干细胞（hASCs）因其丰富性、易获取性及可分化为角膜基质细胞（CSKs）的潜力，成为角膜再生医学的理想细胞来源。三维（3D）组织基质对于模拟天然组织、支持基质再生至关重要。基于透明质酸（HA）的基质因其透明度、生物相容性和可调化学特性，成为有前景的基质替代物。本研究旨在评估HA基生物墨水作为可注射制剂和含hASC-CSKs的3D生物打印构建体的体内生物相容性。
hASCs分化为具有基质细胞特征的CSKs
首先，hASCs在角膜细胞分化培养基（KDM）中分化为hASC-CSKs。分化7天（D7）后，细胞呈现出CSKs的典型形态，包括圆形细胞体和延伸的细胞质突起。免疫荧光染色证实了基质标志物胶原蛋白I型（COL1）和 Lumican（LUM）的表达，以及细胞外基质（ECM）纤维的沉积。
生物打印结构具有高透明度和优异的体外细胞活力
透明度是角膜生物打印的关键属性。多材料打印的HA基结构（包括含细胞和无细胞生物墨水）显示出高光学透明度。活死细胞染色显示，打印后第1天，hASC-CSKs在构建体中保持了高存活率，细胞形态从圆形向更长的表型转变，表明生物打印过程造成的细胞应激极小，且3D环境支持细胞生长。
HA基生物墨水在体内促进早期基质重塑，表现为角膜变薄
为评估体内生物相容性，研究设置了四个实验组：仅基质袋对照组（P）、可注射生物墨水组（IB）、含细胞的可注射生物墨水组（IBC）和含细胞的生物打印构建体组（BPC）。通过前段光学相干断层扫描（AS-OCT）监测发现，所有接受生物墨水处理的组别（IB、IBC、BPC）在移植后初期（D4至D7）出现角膜厚度增加，可能反映了术后早期的暂时性基质水肿。然而，到D14时，所有组的角膜和基质厚度均较D4减少，表明生物墨水变薄和组织重塑正在进行。
HA基生物墨水允许体内角膜整合，伴随炎症和混浊度下降
临床检查显示，术后早期（D4）所有组均出现不同程度的角膜混浊。到D14时，除一例因注射导致后角膜穿孔的动物外，其他组的混浊强度均明显减弱。组织学分析显示，生物墨水存在于角膜基质内，呈淡蓝色区域，与周围的宿主组织区分明显。早期（D7 for P, IB, IBC; D1 for BPC）观察到炎症细胞浸润，但到D10和D14时，炎症在所有组中均明显减轻。定量分析显示，IBC组从D10到D14的炎症细胞密度显著降低（p = 0.001）。
HA基生物墨水在体内支持hASC-CSKs特性
通过人特异性核标志物Ku80追踪移植的hASC-CSKs。在IBC组中，在D7、D10和D14均持续检测到Ku80阳性细胞，证实了移植细胞在生物墨水中的存在。角膜基质标志物Lumican（LUM）的染色显示，宿主基质组织和生物墨水内的hASC-CSKs均表达LUM，移植细胞在移植后14天内均保持了该表型。值得注意的是，细胞形态从D7时的圆形转变为D10和D14时的伸长状并出现细胞质突起，表明细胞正在进行积极的重塑和生长。在BPC组中，由于移植的构建体体积较小且细胞接种密度较低，可检测到的细胞数量有限，但仍观察到Ku80阳性细胞和LUM表达细胞，表明细胞存活和CSK表型的维持。
讨论
本研究在前期工作的基础上，进一步在大鼠角膜基质模型中评估了HA基生物墨水的体内生物相容性。结果表明，该生物墨水在生理条件下能有效交联，并在体内保持结构完整性。可注射生物墨水与宿主角膜组织整合良好，为移植的hASC-CSKs提供了支持性微环境，并保持了其表型。3D生物打印的构建体则表现出良好的光学透明度和体外高细胞活力，并能有效整合到基质袋中。角膜厚度测量和临床观察支持了生物墨水的整合和组织的早期重塑。炎症反应主要与手术干预有关，而生物墨水本身显示出良好的生物相容性。研究局限性包括样本量小、随访时间相对较短等。
结论
本研究证明，基于HA的生物墨水在生理条件下能有效交联，并在体内保持结构完整性。无论是通过细胞注射还是3D生物打印方式递送，该生物墨水都能作为生物相容性支架，支持角膜基质细胞的递送和基质再生，展现了其在未来角膜治疗中的潜力。
实验部分
该研究获得了相关伦理委员会的批准。hASCs从皮下脂肪组织分离并扩增，然后在KDM中分化为hASC-CSKs。HA基生物墨水根据既定方案制备，用于注射或生物打印。生物打印采用多材料方法，交替打印含细胞（较软）和无细胞（较硬）的生物墨水纤维。动物实验使用Rowett Nude（RNU）大鼠，手术创建角膜基质袋后，移植生物墨水或生物打印构建体。通过AS-OCT、临床成像、组织学和免疫荧光等方法进行术后评估。统计分析使用GraphPad Prism进行。
