《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Assembling a complete metabolic pathway enables
Escherichia coli to acquire naphthalene bioremediation ability
王波|王宇|杨琴|王丽娟|高建杰|徐静|李振军|钱岑|邓永东|张文辉|田永生|彭瑞和|姚全红
上海农业科学院生物技术研究所农业遗传与育种重点实验室，中国上海市北迪路2901号，201106
摘要
多环芳烃（PAHs）造成的污染严重威胁着生态系统的可持续性。像萘这样的持久性PAHs污染物一旦释放，极难被完全降解。微生物在修复污染物方面具有天然优势，但由于高效且能够完全降解这些污染物的细菌稀缺，限制了它们在萘修复中的应用。为应对这些挑战，本研究专注于开发用于萘生物修复的工程菌株。我们重新设计并组装了一条包含17个基因的新途径，以实现萘的完全降解，并在大肠杆菌中验证了其有效性。简而言之，这些经过改造的菌株能够在4小时内快速且完全降解1 mM的萘。通过四维无标记定量蛋白质组学分析，发现转化菌株对萘的耐受性增强，并减轻了萘带来的压力。稳定同位素追踪分析表明，工程菌株能够将萘、水杨酸盐和儿茶酚整合到三羧酸循环中。在实验室条件下，工程菌株能够快速修复受污染的水和土壤中的萘。此外，这些工程菌株还能减轻萘对土壤微生物群落的负面影响，并消除其对斑马鱼的生物毒性。总之，本研究开发的工程菌株显示出巨大的潜力，为萘污染地区的快速修复提供了一种可行的策略。
引言
多环芳烃（PAHs）因其高毒性、难降解性和生物累积性而成为著名的环境污染物。由于它们对生态和人类健康的影响，应给予足够的重视[1]。在自然界中，PAHs来源于火山喷发、植物排放和火灾。各种人为活动是导致不同环境（包括土壤、水和大气）中PAHs污染的主要来源。这些持久性污染物在食物链中的转移和累积威胁着人类健康[2],[3],[4]。
PAHs的日益增多已成为一个重要的健康问题。通常，低分子量的PAH化合物具有急性毒性，而高分子量的PAH化合物则具有遗传毒性[5]。一项针对4,765名成年参与者的调查显示，PAHs与肥胖和心血管健康风险有关[6]。另一项在儿童中的研究也得出了类似的结果[7]。据报道，萘可引起皮肤刺激、红细胞破坏和肾毒性[8]。萘的致癌机制主要与蛋白质和DNA加合物有关，而萘醌可能在其致病过程中起重要作用[9]。导致呼吸系统、血液系统、免疫系统和生殖系统出现不良影响的最低萘暴露浓度范围为5.1 – 52 mg/m3[10]。因此，美国环境保护署和欧洲环境署已将PAHs列为环境中的优先污染物。
生物修复技术（包括生物强化、生物刺激、生物通风、堆肥、土地耕作、生物反应器和植物修复）因其低成本、优异的性能和环保性而受到广泛关注。微生物在生物修复中起着主导作用，因为它们能够利用可生物利用的PAHs作为唯一的碳源或能源。然而，超过99%的土壤微生物种群仍无法通过传统技术培养[11]。尽管从PAH污染环境中分离出的许多本土微生物能够有效降解PAHs[12],[13]，但已知能够降解有机污染物的微生物仍无法满足不同环境（包括天然水体、环境颗粒物、深海沉积物、农业土壤和污染场地）中的复杂多样的生物修复需求[14],[15],[16]。实际上，大多数污染区域可能含有多种污染物，如重金属、染料、外源物质、农药、PAHs、多氯联苯和抗生素。这些污染物对微生物降解者有不同的负面影响，导致修复效果不佳[17],[18]。因此，需要寻找能够降解多种污染物并且同时耐受所处环境条件的细菌。总体而言，由于环境适应性、降解效率低、致病性和其他内在缺陷，合适的菌株数量有限[19]。
基因工程技术可用于改变细菌的特性，从而克服这些限制，使其适用于环境修复。通过基因工程还可以扩展或改进微生物降解者的底物范围和降解效率。过表达硝基烷氧化酶和亚硝酸盐单加氧酶基因可以显著提高Geobacillus thermodenitrificans NG80-2在废水中对混合硝基烷的降解效率[20]。萘降解质粒NAH7已被转移到内生菌株Pseudomonas putida中以实现萘的降解[21]。将这种工程菌株接种到植物后，观察到种子发芽率、植物蒸腾作用和萘降解率均有所提高。
在本研究中，我们设计并组装了一条完整的萘降解途径（图1）。属于萘降解途径的所有必要功能基因都经过了优化和人工合成[22]。由独立启动子和终止子驱动的优化基因被用来构建不同的代谢模块。水杨酸盐模块能够在大肠杆菌中将萘有效转化为水杨酸盐。随后，添加了一个水杨酸盐羟化酶基因，将其最终产物转化为儿茶酚，形成一个新颖的上游代谢模块。为了完全降解萘，重新构建了一个儿茶酚降解模块，并与上述上游模块（萘到儿茶酚）在大肠杆菌中共同表达。因此，携带这17个基因的工程菌株能够完全降解萘（图2）。除了完全降解萘外，这些工程菌株还能快速修复自然土壤和水中的萘污染，同时消除萘对斑马鱼和土壤微生物的有害影响。此外，与对照菌株相比，工程菌株对2 mM萘的耐受性显著增强。总体而言，我们的结果表明，通过这种策略可以实现复杂生物降解途径的异源表达，从而可以将细菌用于构建生物修复工程菌株。
部分内容摘录
化学物质和菌株
除非另有说明，所有生化试剂和引物均购自Sangon Biotech（上海）有限公司。酶类购自TaKaRa Biotechnology（大连）有限公司。β-酮二酸酯购自Finetech Industry Ltd.（武汉，中国）。[U-13C]-儿茶酚、pET-28a-c (+)、pCAMBIA-1201、DH 5α和BL21-AI菌株保存在我们的实验室中。能够完全降解儿茶酚的转化菌株BL-cat之前已被构建[23]。
基因结构优化、合成及表达载体pET-nahA-F的构建
原始的萘降解基因来源于NAH7质粒，总大小为82,232 bp。它们位于一个大小为39,116 bp的II类转座子Tn4655上，携带33个开放阅读框。nahAa至nahD编码的酶可将萘转化为水杨酸盐[22]。水杨酸盐是儿茶素或儿茶酚途径的起始底物，是萘降解途径中的一个分支点。除了nahAa外，nahAb、nahAc、nahAd、nahB、nahC、nahD、nahE等基因也参与了这一过程
讨论
生物修复是一种高效且环保的修复技术。由于微生物具有很强的适应性和高降解效率，因此可以从多种环境中分离出用于生物修复的微生物。萘是PAH生物修复研究中的典型对象，因为它在污染场所中普遍存在。大多数降解萘的微生物属于假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、分枝杆菌属、伯克霍尔德菌属、极毛单胞菌属和海洋杆菌属[29]。
结论
在本研究中，我们利用合成生物学技术优化、合成并重构了参与萘完全降解的17个基因。基于分子生物学分析、代谢物鉴定、蛋白质组学分析、电子显微镜观察和稳定同位素追踪分析，完全验证了该降解途径的功能。最终，我们获得了能够高效且完全降解萘的工程菌株BL-nah-cat。
伦理批准声明
动物实验方案按照上海农业科学院的动物福利和伦理审查申请（批准编号SAASXM-0824003）进行。
CRediT作者贡献声明
彭瑞和：写作 – 审稿与编辑，资源准备。钱岑：形式分析。邓永东：实验研究。徐静：实验研究。李振军：实验研究。王丽娟：实验研究。高建杰：形式分析。姚全红：资源准备、项目管理和资金获取。王宇：写作 – 初稿撰写。杨琴：数据可视化。王波：写作 – 审稿与编辑，初稿撰写。张文辉：实验研究。田永生：实验研究，资金获取。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了上海市农业农村委员会（K2025006）、国家自然科学基金（31901069）、上海市自然科学基金（25ZR1402455）、贵州省科技计划项目（QKHZC [2021] No.207）、贵州省青年科技人才项目（QJJ [2022] No.89）以及上海农业科学院的支持。
