《Journal of Ginseng Research》：Dual-targeted liposomes delivering ginsenoside CK attenuate cerebral ischemia-reperfusion injury by suppressing PANoptosis via O-GlcNAcylation of RIPK1/RIPK3
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本研究针对缺血性脑卒中治疗选择有限、血脑屏障(BBB)阻碍药物递送以及缺血再灌注(I/R)损伤中PANoptosis（一种混合性程序性细胞死亡）的难题，开发了转铁蛋白(Tf)和狂犬病毒糖蛋白(RVG)双修饰的负载人参皂苷CK(Ginsenoside CK, GCK)的脂质体(LP/RTG)。研究证实LP/RTG能有效穿越BBB，靶向脑部，并通过增强RIPK1/RIPK3的O-连接β-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰，抑制PANoptosome复合物形成，从而在体外和体内（tMCAO大鼠模型）显著减轻线粒体分裂和PANoptosis，缩小脑梗死体积，为脑I/R损伤提供了新的治疗策略。
脑卒中，尤其是缺血性脑卒中，是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一，对人类健康构成严重威胁。目前，急性缺血性脑卒中的治疗主要依赖于溶栓和取栓，但组织纤溶酶原激活剂(tPA)等药物的治疗时间窗口非常狭窄，仅在症状出现后的4.5小时内有效。更棘手的是，即使成功实现血管再通，随之而来的再灌注过程本身可能引发一系列复杂的病理生理变化，如氧化应激、神经炎症和兴奋性毒性，从而导致神经元死亡和脑微血管损伤，即脑缺血再灌注损伤。由于其潜在的精确机制尚未完全阐明，目前缺乏有效预防再灌注后损伤的策略。
近年来，研究发现脑缺血再灌注会一致性地触发一种名为PANoptosis的程序性细胞死亡。这是一种独特的细胞死亡模式，其中凋亡(Apoptosis)、焦亡(Pyroptosis)和坏死性凋亡(Necroptosis)等多种细胞死亡通路可能被协同调控。在脑缺血再灌注过程中，PANoptosis由先天免疫传感器（如ZBP1、AIM2和RIPK1）启动，并由PANoptosome复合物的组装所驱动。有趣的是，对PANoptosome复合物中的关键蛋白RIPK1或RIPK3进行O-连接β-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰，可以显著削弱PANoptosis。这种修饰通过抑制复合物的形成及其下游信号传导，并降低RIPK3的磷酸化和激活来实现保护作用。O-GlcNAc修饰由O-GlcNAc转移酶(OGT)催化添加，并被O-GlcNAcase(OGA)去除。研究表明，升高的O-GlcNAc修饰水平与减轻的缺血再灌注诱导的脑损伤相关。此外，一些人参皂苷（如人参皂苷Rb1）通过靶向OGT和OGA参与O-GlcNAc修饰的调控。
人参皂苷CK是天然二醇型人参皂苷（包括人参皂苷Rb1）的单体代谢物，已被报道对脑缺血/再灌注损伤具有保护作用。基于这些发现，研究人员推测人参皂苷CK可能通过调节O-GlcNAc修饰来抑制PANoptosis。然而，尽管单体人参皂苷CK具有脑保护作用，但其生物利用度较差。口服人参总皂苷后，脑组织中的平均浓度比血浆中低10至15倍，表明人参皂苷穿越血脑屏障的能力较弱。脂质体递送系统为增强药物靶向性和疗效提供了解决方案。
为了克服这些挑战，并探索新的治疗策略，研究人员在《Journal of Ginseng Research》上发表了一项研究，他们开发了一种新型的双靶向脂质体，用于递送人参皂苷CK，并深入探讨了其对抗脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制。
为开展此项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。他们通过微流控技术制备了不同修饰的脂质体，包括双修饰（转铁蛋白Tf和狂犬病毒糖蛋白肽RVG29）且用人参皂苷CK替代胆固醇的实验组脂质体(LP/RTG)、双修饰但含胆固醇的对照组脂质体(LP/RT)以及仅RVG29修饰的脂质体(LP/RG)，并利用动态光散射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)和高性能液相色谱(HPLC)对其物理特性（粒径、多分散指数PDI、Zeta电位、包封率EE%）和稳定性进行了表征。通过细胞摄取实验（荧光显微镜、流式细胞术）和体内生物分布成像（小动物活体成像）评估了脂质体的靶向性和脑积累能力。体外功能研究采用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)处理的神经元细胞(SH-SY5Y)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型，通过MitoTracker Green和JC-1染色评估线粒体形态和膜电位，并通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测线粒体动力学蛋白（Drp1, Fis1, Opa1, Mfn1, Mfn2）以及PANoptosis相关标志物（凋亡：Bcl2, Bax, Cleaved caspase-3, Cleaved PARP；焦亡：GSDMD, GSDMD-N, GSDME, GSDME-N；坏死性凋亡：RIPK1, p-RIPK3, RIPK3, p-MLKL, MLKL）。体内疗效评估采用大鼠短暂性大脑中动脉阻塞(tMCAO)模型，通过TTC染色测定脑梗死体积，通过尼氏(Nissl)染色、苏木精-伊红(H&E)染色和TUNEL染色评估组织病理学变化和细胞死亡，并通过Western Blot分析脑组织中PANoptosis相关蛋白表达。机制探讨方面，采用分子对接模拟人参皂苷CK与潜在靶点（OGT, OGA）的结合，表面等离子共振(SPR)技术定量分析结合亲和力（解离常数KD），热位移 assay(TSA)评估化合物对靶蛋白稳定性的影响，并通过免疫共沉淀(co-IP)结合Western Blot检测RIPK1和RIPK3的O-GlcNAc修饰水平及其复合物形成情况。
3.1. 脂质体的制备与表征
研究人员成功合成了DSPE-PEG2000-RVG29和DSPE-PEG2000-Transferrin (Tf)缀合物，并采用薄膜水化法制备了三种脂质体 formulations：作为对照的、含有胆固醇的双修饰脂质体(LP/RT)；实验性的、用GCK替代胆固醇且含有RVG29和Tf的双修饰脂质体(LP/RTG)；以及仅由RVG29修饰、负载GCK的单修饰脂质体(LP/RG)。表征结果显示，所有脂质体均呈球形，粒径均匀（约75-76纳米），多分散指数(PDI)低（0.23-0.28），Zeta电位较高（22-29 mV），且LP/RTG和LP/RG对GCK的包封率(EE%)均超过75%。在8天的稳定性考察中，所有制剂的粒径和Zeta电位均保持稳定，表明其具有良好的胶体稳定性。
3.2. 脂质体的摄取和细胞毒性
荧光显微镜和流式细胞术分析表明，在SH-SY5Y（神经元样）细胞和HUVEC（人脐静脉内皮）细胞中，LP/RT和LP/RTG脂质体均表现出比PBS对照组更高的细胞内化水平，其中LP/RTG在HUVEC中的摄取最高。LP/RG在HUVEC中的摄取相对较低。CCK-8实验显示，在测试范围内（0-100 μg/mL），所有脂质体 formulations 对两种细胞的活力均无显著影响（活力 >90%），表明其生物相容性好，细胞毒性低。小动物活体成像显示，Cy5.5标记的脂质体静脉注射后能在主要器官分布，并在脑中积累，其中LP/RT和LP/RTG的脑积累水平显著高于LP/RG，证明了双靶向修饰在增强脑部递送方面的优势。
3.3. LP/RTG和LP/RG脂质体保护神经元和内皮细胞免受OGD/R诱导的线粒体分裂和PANoptosis
在OGD/R处理的SH-SY5Y和HUVEC细胞中，模型组线粒体出现显著碎片化，而LP/RTG和LP/RG预处理能有效维持线粒体的 elongated 形态，保护线粒体完整性。Western Blot分析显示，OGD/R增加了线粒体分裂相关蛋白Drp1和Fis1的表达，降低了融合相关蛋白Opa1、Mfn1和Mfn2的表达，而LP/RTG和LP/RG预处理能显著逆转Mfn2的表达下降。JC-1染色表明，LP/RTG和LP/RG能显著保护线粒体膜电位，防止OGD/R诱导的线粒体去极化。进一步对PANoptosis标志物的检测发现，OGD/R诱导了凋亡（Bax升高、Bcl2降低、Cleaved caspase-3和Cleaved PARP增加）、焦亡（GSDMD-N和GSDME-N增加）和坏死性凋亡（p-RIPK3和p-MLKL增加）的激活。LP/RTG和LP/RG预处理能显著抑制这些标志物的变化，而LP/RT则无此保护作用。这表明负载GCK的脂质体通过保护线粒体功能和抑制PANoptosis的关键执行分子，在体外对神经元和内皮细胞具有强大的保护作用。
3.4. LP/RTG和LP/RG减轻大鼠脑I/R损伤后的神经元PANoptosis
在大鼠tMCAO模型中，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织出现大面积梗死。LP/RTG和LP/RG治疗能显著减小梗死体积，而LP/RT组和游离GCK治疗组的效果不明显或较弱。组织学分析（Nissl, H&E, TUNEL染色）显示，LP/RTG和LP/RG治疗能显著保留神经元结构，减少组织损伤和凋亡细胞数量。对脑组织蛋白的分析证实，LP/RTG和LP/RG能显著逆转tMCAO诱导的PANoptosis相关蛋白的变化：降低促凋亡蛋白Bax和Cleaved PARP，提高抗凋亡蛋白Bcl2，抑制焦亡执行蛋白GSDMD-N和GSDME-N的活化，以及降低坏死性凋亡关键蛋白p-RIPK3和p-MLKL的水平。主要器官的H&E染色未发现明显毒性，表明治疗具有良好安全性。
3.5. 人参皂苷CK与O-GlcNAcase结合并增强RIPK1和RIPK3的O-GlcNAc修饰
为阐明GCK的作用机制，研究人员进行了分子对接、SPR、TSA和co-IP实验。分子对接预测GCK与OGA具有高亲和力（Vina score: -9.1），并能与OGA催化活性关键残基K98相互作用。SPR分析证实了GCK与OGA的直接结合，KD值为3.89 μM。TSA显示GCK处理能增加OGA的热稳定性。Co-IP实验发现，OGD/R降低了SH-SY5Y和HUVEC细胞中RIPK1和RIPK3的O-GlcNAc修饰水平，并促进了RIPK1-RIPK3复合物的形成。而LP/RTG、LP/RG预处理，以及游离GCK和OGA抑制剂Thiamet-G，均能有效恢复RIPK1和RIPK3的O-GlcNAc修饰水平，并破坏它们的复合物形成。这表明GCK通过结合并可能抑制OGA的活性，增强RIPK1和RIPK3的O-GlcNAc修饰，从而干扰PANoptosome的组装，抑制PANoptosis。
综上所述，本研究成功开发了Tf和RVG双靶向的、负载人参皂苷CK的脂质体(LP/RTG)，该系统能有效穿越血脑屏障，靶向脑部病变区域。研究证实，LP/RTG能通过保护线粒体功能，并通过增强RIPK1/RIPK3的O-GlcNAc修饰来抑制PANoptosome复合物的形成，从而在细胞和动物模型中显著减轻脑缺血再灌注损伤，表现为梗死体积缩小、神经元死亡减少以及PANoptosis相关标志物的正常化。该研究不仅为脑卒中的治疗提供了一种具有前景的新策略，将药物递送与多靶点作用机制相结合，也深化了对人参皂苷CK神经保护作用分子机制的理解，特别是其通过调控蛋白质翻译后修饰（O-GlcNAc修饰）来干预新型程序性细胞死亡通路PANoptosis的作用。此外，研究还展示了利用天然活性成分（如GCK）作为脂质体膜材组成部分的可行性，为纳米载药系统的设计提供了新思路。尽管仍需进一步的优化和安全性评估，但这项研究为推进脑卒中治疗策略向临床应用迈进奠定了坚实的基础。
