全PEG样嵌段共聚物自组装为隐形纳米载体用于药物递送

《Advanced Science》：All-PEG-Like Block Copolymers Self-Assemble into Stealth Nanocarriers for Drug Delivery

本文报道了一种完全由聚（寡聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯）（POEGMA）构成的自组装纳米颗粒平台，该平台通过设计具有不同寡聚乙二醇侧链的AB二嵌段共聚物实现。研究表明，仅二乙二醇（EG2）与三乙二醇（EG3）侧链的一个单元差异足以诱导两亲性，并在嵌段长度比至少为0.25时实现室温以上的温度触发自组装。通过调控疏水嵌段组成，可获得在20°C–40°C生理相关温度范围内稳定的纳米颗粒，并能高效包载多种疏水药物。值得注意的是，POEGMA包裹的阿霉素在体外保持了药物活性，并因药代动力学改善而在体内展现出优于游离阿霉素的疗效。更重要的是，这些纳米颗粒能够规避抗PEG抗体的识别，展现出隐形特性。本研究为具有可调热响应性和高治疗潜力的全POEGMA基隐形药物递送系统开发提供了一个多功能平台。

设计与合成简单的AB型EG3-EG2二嵌段POEGMA库

基于聚乙二醇（PEG）在药物递送中的应用广泛性及其日益凸显的免疫原性问题，本研究致力于开发一种完全由聚（寡聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯）（POEGMA）构成的自组装纳米颗粒。POEGMA是一种隐形聚合物，不表现出PEG的抗原性。研究人员假设，由EG3MA和EG2MA单体构成的AB二嵌段共聚物，即使侧链仅相差一个乙二醇单元，也足以赋予其两亲性，使其在水性介质中自组装成纳米颗粒，其中EG3嵌段形成冠状结构，EG2嵌段形成核芯。

为了验证这一假设，研究团队通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合的两步法合成了一系列EG3-EG2二嵌段共聚物库，其中疏水嵌段（EG2）和亲水嵌段（EG3）的聚合度（DP）各不相同。首先合成EG3 POEGMA均聚物作为大分子链转移剂（macro-CTA），进而用于合成EG2嵌段。所有纯化后的聚合物均通过核磁共振氢谱（¹H NMR）和尺寸排阻色谱-多角度激光光散射（SEC-MALS）进行了表征，以确保其数均分子量（M_n）、重均分子量（M_w）和摩尔质量分布（D_m）符合要求，仅选择D_m≤ 1.2的聚合物进行后续研究。

二嵌段POEGMA库的物理表征

对库中聚合物（以聚合物D，EG3₁₆₇-EG2₈₅为代表）的物理表征揭示了其自组装行为。通过监测600 nm处吸光度随温度的变化，确定了聚合物的相变温度（T_t），聚合物D在100 μM浓度下的T_t为42.5°C，且相变行为完全可逆。动态光散射（DLS）分析显示，聚合物D在25°C时流体动力学直径（d_h）为7 ± 2 nm，对应其单分子状态；而升温至30°C（其临界胶束化温度，CMT）以上时，d_h增加至40 ± 10 nm，表明发生了温度依赖的自组装形成纳米颗粒。这些纳米颗粒在CMT至T_t的宽温度范围内尺寸稳定。

小角X射线散射（SAXS）分析进一步证实了纳米颗粒的球形结构，通过Guinier图计算得出其旋转半径（R_g）为16.8 ± 1.45 nm，且数据符合模糊球模型。低温透射电子显微镜（cryo-TEM）在37°C下观察到了水合状态的纳米颗粒，图像分析显示其直径约为18 ± 3 nm。

研究确定了EG3-EG2二嵌段共聚物自组装的边界条件：单个嵌段的相对DP需至少占总DP的25%，才能赋予共聚物足够的双亲性以驱动自组装。然而，该简单库中的聚合物均需在高于室温的温度下才能自组装。

增加疏水嵌段疏水性以获得室温稳定的纳米颗粒用于药物递送

为了使POEGMA二嵌段共聚物能在室温下自组装，并获得在室温至体温范围内稳定的纳米颗粒（这对生物医学应用至关重要），研究团队合成了一个更复杂的二嵌段POEGMA库，即通过在水性嵌段中随机共聚EG1MA单体来系统性地增强疏水嵌段的疏水性（以聚合物F，EG3₁₁₉-EG2₁₂₀/EG1₆₇为代表）。

表征结果显示，聚合物F的T_t为44.5°C，但其CMT低于室温（RT）。DLS表明其在RT和体温下均能形成尺寸约为44 ± 10.6 nm的稳定纳米颗粒。SAXS分析显示其组装体呈椭球状，R_g为12.6 ± 1.4 nm。Cryo-TEM在RT下观察到了直径约12.2 ± 4 nm的纳米颗粒。值得注意的是，即使通过自由基处理去除RAFT聚合引入的疏水性CTA末端基团，也对聚合物的自组装行为和相变温度没有影响，表明自组装主要由嵌段结构本身驱动。

药物封装与生物学评价

为展示该平台的实用性，研究人员通过简单孵育法，将多种具有不同疏水性（log P值~1–9）的小分子化疗药物（如索拉非尼、厄洛替尼、拉帕替尼、氟维司群、紫杉醇、阿霉素）封装到聚合物F的纳米颗粒中，封装效率可达50%–80%。通过优化条件（如薄膜水化法或缓冲液交换法），紫杉醇的封装效率可超过90%。载药后的纳米颗粒尺寸保持稳定，且在含20%血清的培养基中孵育168小时仍能保持胶体稳定性。

药物释放实验表明，与游离阿霉素（Dox）的快速释放不同，POEGMA纳米颗粒包裹的Dox在168小时内释放缓慢，且在较低pH值（模拟肿瘤微环境或溶酶体环境）下释放略有加速，显示出缓释特性和轻微的pH敏感性。

生物安全性评估表明，POEGMA ‘F’在0–250 μM浓度范围内对MC38和CT26小鼠结直肠腺癌细胞系无细胞毒性。体外药效实验显示，封装在POEGMA中的Dox在72小时内的半数抑制浓度（IC₅₀）与游离Dox相当，但早期时间点游离Dox的细胞毒性更强。然而，流式细胞术和共聚焦荧光显微镜分析表明，封装Dox的细胞摄取量是游离Dox的1.5–3倍，推测其细胞毒性差异可能与纳米颗粒通过巨胞饮进入细胞后，药物从内体/溶酶体中释放并转运至细胞核（Dox的主要作用部位）的效率有关。

体内药代动力学（PK）研究显示，与游离Dox相比，封装在POEGMA纳米颗粒中的Dox的消除半衰期（t_1/2）从1.5分钟延长至8.5分钟，总药物暴露量（AUC）提高了5倍。在携带C26同系肿瘤的小鼠模型中，单次静脉注射等效剂量10 mg/kg的Dox后，与游离Dox相比，POEGMA封装的Dox在肿瘤消退和小鼠生存期方面均表现出显著优越的疗效。

隐形特性验证

最后，通过间接ELISA实验验证了POEGMA纳米颗粒的隐形特性。结果显示，即使在高浓度下，POEGMA二嵌段纳米颗粒与商业化的抗PEG IgM和IgG抗体的结合可忽略不计，而阳性对照PEG则表现出强烈的剂量依赖性结合。这证实了基于EGnMA（n ≤ 3）的POEGMA纳米颗粒能够有效规避预先存在的抗PEG抗体的识别。

结论

本研究成功利用POEGMA的低临界溶解温度（LCST）相行为，设计并合成了完全由POEGMA构成的自组装纳米颗粒。通过调控嵌段共聚物中EG侧链长度和组成，实现了对其两亲性、自组装温度窗口和纳米颗粒稳定性的精确控制。所制备的POEGMA纳米颗粒能够高效封装疏水药物，改善其药代动力学，增强体内疗效，并关键地避免了抗PEG抗体的识别，为克服传统PEG化纳米载体免疫原性等局限性提供了一种新型、多功能且具有高临床转化潜力的隐形药物递送平台。

展望

该研究确立了一类全新的全POEGMA自组装纳米颗粒，为药物递送提供了一个模块化且具有隐形兼容性的平台。未来工作可集中于将平台扩展至生物制剂的封装、探索替代给药途径，以及在临床相关模型中进行详细的免疫学研究。总之，这项工作为开发安全、高效、可定制的POEGMA基纳米载体奠定了基础，有望解决传统PEG化纳米载体的局限性。

方法

材料与合成：所有POEGMA二嵌段共聚物均通过两步RAFT聚合法合成，使用4-氰基-4-(硫代苯甲酰硫基)戊酸作为CTA，AIBN作为引发剂。单体在使用前经碱性氧化铝柱去除阻聚剂。聚合物通过核磁共振和SEC-MALS进行化学表征。

物理表征：通过紫外-可见分光光度法测量600 nm吸光度随温度的变化确定T_t和CMT。通过DLS测量纳米颗粒流体动力学直径。通过SAXS分析纳米颗粒的形状、尺寸和R_g。通过cryo-TEM观察纳米颗粒形貌。

生物学实验：通过MTT法评估细胞毒性和药物体外效力。通过共聚焦显微镜和流式细胞术分析细胞摄取。通过间接ELISA评估抗PEG抗体结合。动物实验遵循杜克大学IACUC批准的方案进行，通过荧光法测定血浆中Dox浓度进行PK分析，并在C26同系肿瘤模型中评估抗肿瘤功效。

统计分析：数据以均值±标准误表示，使用GraphPad Prism进行统计学分析，p< 0.05认为有统计学意义。