TriCON：基于碳材料的三模态纳米平台通过CRISPR/Cas9编辑PVR基因协同化疗-免疫治疗胰腺癌

《Advanced Science》：TriCON: A Carbon-Based Triple-Modal Nanoplatform for Pancreatic Cancer Therapy

本研究开发了一种名为TriCON（三重会聚肿瘤纳米疗法）的三模态治疗平台，用于胰腺导管腺癌（PDAC）治疗。该碳基纳米平台可共同装载阿霉素（DOX）和CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP），通过编辑脊髓灰质炎病毒受体（PVR）基因、诱导免疫原性细胞死亡（ICD）及激活自然杀伤（NK）细胞，实现时空协同的化疗-免疫联合治疗，为改善PDAC免疫抑制微环境（TIME）提供了新策略。

　　

胰腺导管腺癌（PDAC）因其高恶性度和免疫抑制性肿瘤微环境（TIME），对常规治疗手段响应不佳。重新编程TIME成为增强肿瘤免疫治疗效果的有前景策略。基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑为精确调控肿瘤免疫抑制相关内源基因表达提供了可行途径。然而，现有递送载体在生物安全性、扩增能力和靶向准确性方面面临三重挑战。

TriCON纳米平台的设计与构建

为解决上述挑战，研究人员开发了TriCON（三重会聚肿瘤纳米疗法）三模态治疗平台。该平台具有三个核心机制特性：时空收敛性、刺激响应可控性和肿瘤微环境调节导电性。TriCON以碳基球形纳米颗粒（CSN）为核心，通过湿法氧化在其表面引入羟基和羧基以增强功能化。首先将阿霉素（DOX）装载到中孔CSN中（称为DOX@CSN）。随后，将带负电的Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）与阳离子聚乙烯亚胺（PEI）整合以建立电荷平衡，并通过静电作用与DOX@CSN结合。最后，在表面包覆对肿瘤细胞有高亲和力的细胞穿膜肽（CPP），形成最终的TriCON纳米复合物。表征结果显示，TriCON粒径约为262纳米，zeta电位为+13.4毫伏，具有良好的分散性和稳定性。

药物释放与安全性

TriCON在酸性条件下（pH 5.5）表现出显著的pH响应性药物释放特性，86.25%的DOX在pH 5.5的PBS缓冲液中释放，显著高于pH 7.4条件下的45.32%。RNP的释放也表现出类似的pH响应特性。溶血实验和细胞毒性试验表明，TriCON具有良好的生物相容性，对正常胰腺细胞（HPDE6C7）的存活率超过85%，且未引发细胞炎症反应。

细胞摄取与体外效应

细胞摄取实验表明，TriCON/RNP在6小时与内体共定位，8小时与溶酶体共定位，12小时后能有效逃逸溶酶体，并在细胞核内富集，显示出强大的溶酶体逃逸能力。与商业脂质体（LIPO/RNP）相比，TriCON显著增强了Cas9的细胞摄取。DOX在6小时内成功富集于细胞并与细胞核共定位。体外细胞毒性实验显示，DOX@CSN-PEI对BxPC3和SW1990细胞具有剂量依赖性细胞毒性作用，其半数抑制浓度（IC₅₀）分别为17.68和30.16微克/毫升。

PVR基因编辑效率

针对胰腺癌细胞中高表达的PVR基因，研究设计了特异性sgRNA。体外实验证实，TriCON/RNP-PVR能有效敲低PVR表达，其中sgRNA1显示出优异的敲除效果。T7E1检测和Sanger测序分析表明，TriCON/RNP-PVR处理组的基因突变频率超过70%，插入缺失（indel）总效率达77%，显著高于游离RNP处理组。蛋白质印迹分析进一步证实，TriCON/RNP-PVR组的PVR敲低效率高于脂质体组。

增强NK细胞杀伤作用

研究发现，DOX处理可通过促进活性氧（ROS）释放上调PDAC细胞中PVR的表达。TriCON/RNP-PVR通过协同沉默PVR增强了DOX的细胞毒性作用。与NK细胞共培养后，TriCON/RNP-PVR + NK处理显著抑制了肿瘤细胞生长和克隆形成能力。同时，DOX诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）显著增加了高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的表达和细胞外分泌，促进钙网蛋白（CRT）在细胞膜表面的暴露，并提高细胞内三磷酸腺苷（ATP）浓度。细胞因子检测显示，TriCON/RNP-PVR显著提升了肿瘤细胞中CXCL10、IFN-α1、IL-1β和TNF-α等炎症细胞因子的表达，以及共培养系统中颗粒酶B（GZB）、IFN-γ等抗肿瘤效应分子的水平。

体内抗肿瘤效果

在SW1990-LUC异种移植瘤模型中，尾静脉注射TriCON/RNP-PVR联合NK细胞治疗显著抑制了肿瘤生长，并几乎消除了肿瘤，显著提高了小鼠的生存率。体内分布实验显示，Cy7标记的TriCON纳米颗粒在注射后24小时内在肿瘤部位富集，信号持续至48小时，而游离Cy7染料组未见肿瘤部位荧光富集。 Tunel和Ki-67染色表明，TriCON/RNP-PVR + NK处理组肿瘤细胞凋亡增加、增殖减少。肿瘤组织T7E1检测显示PVR基因编辑效率为14.2%，免疫组化证实PVR表达降低。此外，该治疗显著提升了肿瘤组织和血清中TNF-α、GZB、IL-1β和IFN-γ的水平。重要的是，在心、肝、脾、肺、肾、脑等器官中未检测到PVR基因的脱靶编辑。

原位胰腺癌模型验证

在免疫正常的C57BL/6小鼠原位胰腺癌（Pan02-LUC）模型中，TriCON/RNP-PVR治疗同样显著抑制了肿瘤生长。基因组分析证实肿瘤组织中有高效的PVR基因编辑，而主要器官中未检测到脱靶效应。流式细胞术和多重免疫荧光染色分析显示，TriCON/RNP-PVR治疗组肿瘤组织中NK细胞浸润水平显著高于其他组，且NK细胞活化标志物信号更强。这些结果通过qPCR和ELISA得到了进一步验证。

结论

TriCON纳米平台能够高效递送CRISPR/Cas9 RNP，在胰腺癌中特异性编辑PVR免疫检查点基因，并通过DOX诱导的ICD和NK细胞激活，实现协同抗肿瘤效果。该策略为胰腺癌的免疫联合基因治疗提供了新的框架和临床转化前景。