《British Journal of Pharmacology》：Covalent fluorescent probes for 2-arachidonoylglycerol metabolic pathways
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这篇综述系统梳理了用于可视化内源性大麻素2-AG代谢关键酶（DAGL、MAGL、ABHD6和ABHD12）活性的共价荧光探针（ABPs）的最新进展。文章重点介绍了从广谱探针到定制化探针的设计策略、应用场景（如活性蛋白质谱分析和超高分辨率成像）及其在揭示酶功能、推动神经精神疾病药物发现中的价值，并指出了当前工具包的空白领域和未来发展方向。
摘要
共价荧光探针已成为在复杂生物系统中可视化酶活性的通用化学工具。当针对特定应用进行定制时，从基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）到酶活性的高时空分辨率成像，这些探针为快速脂质代谢提供了独特的见解。本文将总结当前针对2-花生四烯酰甘油（2-AG）代谢酶（二酰基甘油脂肪酶（DAGL）、单酰基甘油脂肪酶（MAGL）、ABHD6和ABHD12）的共价荧光探针的研究现状。
1 引言
共价荧光探针的发展极大地扩展了药理学工具包，使得在复杂生物系统中精确可视化酶活性成为可能。与免疫组织化学不同，它们可以高度定制，并直接报告特定空间和时间的酶活性，而不仅仅是蛋白质丰度。通过结合一个亲电弹头，该弹头可逆或不可逆地与活性位点的亲核催化残基发生共价反应，这些探针作为基于活性的探针（ABPs）发挥作用。这种多功能性支持从通过ABPP进行化学蛋白质组学图谱绘制到酶活性的原位成像等多种应用。
内源性大麻素系统（ECS）体现了对时空分辨率的需求。ECS通过调节中枢神经系统（CNS）中的神经传递来调节情绪、食欲、疼痛和奖赏处理。其主要信号脂质，2-花生四烯酰甘油（2-AG）和N-花生四酰乙醇胺（AEA，anandamide）在神经元突触激活大麻素1型受体（CB1R）。这些脂质池受到丝氨酸水解酶的严格调控：二酰基甘油脂肪酶（DAGLα和DAGLβ）合成2-AG，而2-AG主要被单酰基甘油脂肪酶（MAGL）降解，α/β-水解酶结构域包含蛋白ABHD6和ABHD12也参与其中。这些通路的失调与神经精神和神经系统疾病有关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁和焦虑。
选择性共价探针的最新进展，连同改进的分析方法，为研究这些复杂过程提供了前所未有的机会。
2 DAGL靶向探针
DAGLα主要在中枢神经系统表达，而DAGLβ更多见于外周组织和免疫系统。这两种亚型都包含一个Ser-His-Asp催化三联体，但与许多丝氨酸水解酶不同，它们很难被传统的广谱ABPs（如氟磷酸酯-罗丹明（FP-Rh））检测到。
为解决这一问题，Cravatt实验室开发了HT-01（化合物2），这是第一个DAGL导向的荧光ABP。基于已确立的三唑脲化学型，HT-01实现了对内源性DAGLβ活性的增强可视化。随后，研究人员开发了MB064（化合物4），这是第一个DAGLα导向的荧光ABP，源于临床药物四氢利平他汀（orlistat），其β-内酯弹头通过点击化学连接BODIPY荧光团。MB064在小鼠脑膜中提供了可靠的DAGLα活性读数。
基于三唑脲支架，DH376（化合物6）和DO34被开发出来，对DAGLα和DAGLβ具有纳摩尔级效力。DH376通过其炔基手柄被转化为DH379（化合物7），这是一种带有BODIPY报告基团的定制荧光探针，允许对两种DAGL亚型进行凝胶ABPP分析。总之，一套多功能的广谱和定制ABPs已被开发用于DAGL，但目前尚无可用于在细胞、类器官、组织切片、完整动物或人体中可视化DAGL活性的特异性ABPs或PET示踪剂。
3 MAGL靶向探针
MAGL是将2-AG水解为花生四烯酸的主要酶，从而调节大脑中CB1R介导的过程和炎症。由于其在中枢脂质信号传导中的核心作用，MAGL作为一个治疗靶点引起了相当大的兴趣。
Cravatt实验室发现了O-六氟异丙基（HFIP）氨基甲酸酯对2-AG水解酶（MAGL和ABHD6）具有选择性，并由此开发了MAGL选择性HFIP氨基甲酸酯JW651（化合物8）和第一个用于MAGL和ABHD6的荧光共价探针JW912（化合物9）。JW912需要在选择性抑制剂存在下才能报告特定酶的细胞分布。
JW651被进一步改造为JW651yne，作为点击化学ABPP实验中的两步探针。利用这个手柄连接Cy5荧光团，产生了LEI-463（化合物10），这是第一个选择性、共价、不可逆的MAGL荧光探针。LEI-463实现了MAGL的药理学STORM超分辨率成像，生成了第一个纳米级的MAGL亚细胞图谱。
最近，LEI-463及其类似物被应用于新鲜冷冻人脑组织的基于活性的组织学分析，首次实现了人脑组织中MAGL的高分辨率空间图谱绘制。同时，Nazaré及其同事开发了一个模块化的MAGL探针平台（化合物11），该平台保持了高效力和高选择性，并应用于神经元和癌细胞的亚细胞MAGL成像以及患者来源的外周血单核细胞中的生物标志物定量。
同一研究小组通过巧妙地将BODIPY荧光团直接嵌入疏水支架中（化合物13），实现了探针的小型化。这些紧凑型探针保持了纳摩尔级效力，同时改善了溶解性等物理化学性质，并实现了脑类器官成像、荧光偏振测定、流式细胞术和放射自显影。
总之，MAGL靶向探针结合了出色的选择性、效力和化学多功能性，实现了强大的成像应用。未来的一个方向是开发能够报告MAGL活性而不会永久失活酶的探针。
4 ABHD6和ABHD12靶向探针
除了MAGL，丝氨酸水解酶ABHD6和ABHD12也参与2-AG的水解，ABHD6主要活跃于突触后位点，ABHD12则存在于小胶质细胞中。尽管它们具有相关性，但针对这些酶的探针开发仍然有限。迄今为止，唯一的专用工具是双重靶向ABHD6和ABHD12的两步ABP JJH350（化合物14），尚未报道针对其中任何一种酶的选择性荧光探针。
然而，ABHD6的混杂活性位点使得其他定制探针能够偶然标记它。DAGL导向的探针（如HT-01、MB064和DH379）以及MAGL导向的JW912都显示出ABHD6活性。广谱探针如FP-Rh也标记ABHD6和ABHD12，但特异性有限。对于ABHD12，JJH350的引入支持了构效关系研究，最终导致了强效、选择性和体内活性的ABHD12抑制剂DO264的发现。
总之，与DAGL和MAGL相比，ABHD6和ABHD12仍未得到充分探索。现有的探针主要依赖于交叉反应性或两步策略，限制了它们在高分辨率成像中的应用。未来的努力应侧重于将JJH350或DO264等支架改造为荧光探针，从而能够直接可视化细胞和组织中的ABHD6和ABHD12活性。
5 结论与展望
共价荧光探针已成为研究2-AG信号传导不可或缺的工具，能够从体外测定到完整脑切片直接可视化酶活性，进而通过直接测量靶点结合、解析亚型选择性以及将酶抑制与体内生理和时空变化联系起来，产生药理学见解。该领域已从广谱探针（如FP-Rh）发展到针对DAGL和MAGL的日益定制化的设计。
尽管取得了这些进展，一些挑战仍然存在。对于DAGL，实现选择性且不与ABHD6发生交叉反应是困难的。来自晶体学、冷冻电镜或AlphaFold的DAGL结构见解可能会加速探针开发。更广泛地说，需要能够报告酶活性而无需不可逆失活的探针，以便在活细胞和组织中进行动态追踪。此外，ABHD6和ABHD12仍然缺乏专用的荧光探针。
除了2-AG代谢，内源性大麻素的AEA分支在很大程度上仍未用共价荧光ABPs进行探索。解决这些空白将完善用于精确研究ECS酶以辅助药物发现和开发的化学生物学工具包。
